唾液外泌體在口腔鱗狀細胞癌的研究進展

徐英嬌，王 姍

口腔癌是最常見的頭頸部惡性腫瘤之一，90%以上為口腔鱗狀細胞癌(oral squamous cell carcinoma，OSCC)[1]。在臨床早期(T1)被檢測到，存活率可達80%，但在晚期階段就診(T3～T4)，存活率降至20%～30%[2]。因此，早發現、早診斷、早治療有利于提高口腔癌的治愈率和患者生存率。目前，口腔癌早期診斷依然依靠病理活檢，此方法雖然被譽為“金標準”，但有創過程降低了患者依從性，且伴有診斷主觀性特征。為此，尋找無創、客觀的早期診斷方法是口腔癌早期診斷的熱點。

近年來，無創檢測技術發展迅速。唾液作為“人體的鏡子”，可以反映人體的生理和病理狀態[3]。由于唾液中含有脫落的口腔黏膜細胞、DNA或RNA分子、細胞因子、細胞外囊泡(extracellular vesicles，EV)等，且診斷中具有非侵入性、廉價、易于操作等優點,使唾液成為篩查和診斷 OSCC 的理想液體[4]。但唾液蛋白和RNA離開其最佳環境時易降解，導致敏感性和特異性不足，需用蛋白酶抑制劑和核酸酶抑制劑穩定唾液成分，保持其完整性。

外泌體可存在于唾液中，由于其在癌癥發生發展過程中的生物學作用，且唾液外泌體的脂質雙層結構保護外泌體的內部物質，減少了唾液的復雜性，為疾病診斷提供了更穩定和準確的臨床信息。越來越多的研究人員開始關注唾液外泌體的研究，將其定義為理想生物標志物[5]。唾液外泌體的研究為口腔癌早期診斷提供了新面貌和廣闊前景。

唾液外泌體具有一般意義外泌體的特性[6]，屬于細胞外囊泡系統，EV根據大小和來源可分為外泌體、微泡/胞外體和凋亡小體三種[7]。外泌體起源于多泡體(multivesicular body，MVBs)，通過內溶酶體途徑以內泌體膜向內出芽形成[8]，形成與分泌過程見圖1。外泌體含有蛋白、核酸和脂類等生物活性分子的納米級囊泡，在透射電鏡下呈現雙凹碟形或杯狀形態，直徑為30～150 nm，密度為1.13～1.19 g/mL[9]，主要特征見圖2。

圖1 外泌體的形成與分泌過程

圖2 外泌體的主要特征

因為唾液外泌體類似細胞膜的脂質分子層可以防止內容物降解，并且在不同體液中保持其穩定性，來自宿主細胞的外泌體所攜帶的核酸和蛋白質在脂質分子層保護下可有效反映受試者病理生理條件。已有研究表明外泌體通過促進細胞增殖或改變微環境來參與和促進腫瘤進展全過程，現將目前唾液外泌體中成分及對預后診斷意義進行綜述。

1 唾液外泌體中的RNA

唾液中含有多種的細胞外RNA，包括miRNA和mRNA，還有一些不參與編碼蛋白的RNA分子，如PIWI蛋白相互作用RNA(piRNA)、環狀RNA(circRNA)、長鏈非編碼RNA(LncRNA)等[10]。高通量測序顯示人類唾液中最豐富的小RNA是piRNA(7.5%)和miRNA(6.0%)，而與整個唾液相比，miRNA和piRNA在外泌體中富集程度更高，這一發現表明唾液外泌體中miRNA和piRNA檢測可能更具特異性與發展空間[5]。

1.1 唾液外泌體信使RNA(mRNA)

mRNA含有宿主及口腔微生物的基因轉錄信息。雖然僅占細胞總 RNA 的 2%～5%，但種類多、代謝活躍，可反映機體生理和病理狀態[11]。多項研究證明，mRNA可作為穩定分子存在于唾液中[12]，用超速離心法提取分離全唾液的外泌體，微陣列分析顯示，509個mRNA核心轉錄產物相對穩定地存在于外泌體中。外泌體不僅可以保護RNA在體外不被酶降解，還能夠作為載體將RNA運送到靶細胞中，發揮特定的作用。在體外，熒光標記的唾液外泌體可與口腔角質形成細胞通信，將外泌體的遺傳信息轉移到角質形成細胞，改變基因表達[13]。提示唾液外泌體中的 mRNA 可用于疾病診斷。

1.2 唾液外泌體微小RNA(miRNA)

miRNA是一種由內源性基因編碼的無編碼蛋白質功能的短鏈RNA，通過對各自靶基因的特異性信使mRNA進行降解或翻譯抑制，從而達到對靶基因表達的轉錄后調控[14]。研究表明，癌細胞可以選擇性地將選定的miRNA打包進入外泌體中，發揮腫瘤抑制劑或致癌劑的功能[15]。外泌體中miRNA的表達模式比循環游離miRNA 更貼近腫瘤組織中miRNA的表達，因此認為將外泌體中的miRNA作為生物標志物信度更高[16]。Gai等[17]通過電荷沉淀技術分離唾液細胞外囊泡，通過芯片技術和qRT-PCR檢測miRNA的差異表達，結果顯示，與對照組相比，miR-512-3p 和miR-412-3p在OSCC患者唾液EV中上調，ROC曲線表明二者對OSCC診斷具有較好的鑒別能力，可能作為潛在的生物標志物。張學武等[18]驗證外泌體miR-512-3p 通過下調Gas2促進TSCC細胞增殖。Coon等[19]研究證實miR-365在細胞外泌體或細胞外囊泡的存在，且miR-365很可能成為口腔鱗狀細胞癌外泌體中的潛在生物標志物。唾液外泌體miR-24-3p是一種潛在的新型OSCC診斷生物標志物，He等[20]報道 miR-24-3p可通過靶向PER1維持OSCC細胞增殖，ROC曲線分析AUC為0.738(95%CI: 0.589～0.886,P=0.02)、敏感性和特異性分別為64.4%和80.0%，對OSCC也有較好的鑒別能力。

1.3 唾液外泌體長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)

lncRNA是一種長度超過200個核苷酸且缺乏完整的開放閱讀框的不具有蛋白質編碼功能的RNA,在維持腫瘤細胞干性促進腫瘤演進中具有重要作用[21]。有報道指出，可在唾液中分離得到的外泌體lncRNA HOTAIR和MALAT-1，Tang等認為HOTAIR可作為口腔癌轉移風險的潛在生物標志物[22]，雖然MALAT-1在以往其他癌癥具有區分是否轉移的潛力但在口腔癌中還需進一步的數據支持。盡管目前lncRNA作為腫瘤診斷或預后評估生物標志物的研究尚處于起步階段，但外泌體中的lncRNA提取方便，在環境中能夠穩定存在，為進一步深入研究提供了有利條件。

1.4 唾液外泌體環狀RNA(circRNA)

circRNA是一類長的、非編碼的內源性RNA分子，形成共價連續封閉環，抵抗RNA外切核酸酶[23]。在無細胞的外泌體中，它的出現更具穩定性。有假說認為，含有環狀RNA的外泌體可能被受體細胞吸收，從而影響基因表達的轉錄后調控，并影響腫瘤的微環境[24]。良好的穩定性與較強的參與能力有望使circRNA成為唾液診斷的新型標志物。2015年，Bahn等[25]通過高通量RNA測序和深度生物信息學分析，首次驗證circRNA的存在于唾液游離碎片中。2018年，Zhao等[26]在一項研究中首次證實hsa_circ_0001874和hsa_circ_0001971在口腔癌患者中表達上調，具有診斷OSCC的潛力。最近Ramanathan提出circRNA可以起到類似海綿一樣的作用，形成circ RNA-miRNA軸，調節mRNA的表達，在OSCC中，不同的環狀RNA的過表達表現出腫瘤進展和腫瘤抑制作用[27]。除了以上類型RNA外，唾液外泌體中的其他類型RNA，例如嵌合RNA，病毒RNA、tRNA、小核RNA、piRNA在口腔癌的早期診斷中也初見端倪，都具有廣闊空間。

2 唾液外泌體中的DNA

相較于外泌體中大量的RNA，也有一些研究指向基因組DNA和線粒體DNA(mtDNA)的研究，其優勢在于外泌體中包含的DNA與其來源腫瘤細胞DNA具有高度一致性，提示外泌體DNA可作為檢測致癌性突變的有效生物標志物。

唾液外泌體存在的DNA是循環腫瘤DNA(circulating tumor DNA,ctDNA)，ctDNA是由腫瘤細胞釋放到循環系統的DNA，主要來源于凋亡的腫瘤細胞、壞死的腫瘤細胞和腫瘤細胞的外排物，是游離 DNA 中攜帶腫瘤特有突變的部分DNA[28]。ctDNA不僅存在血液中，也存在于其他體液中如唾液中，唾液基因組分析，ctDNA 70%來自宿主，30%來自口腔微生物群[29]，可用于液體活檢。通過唾液腺超濾、被動擴散或主動轉運，ctDNA可以從局部部位和血液進入唾液，攜帶原發腫瘤的信息[30-31]，由于稀釋和污染較小，唾液ctDNA的分析比血液中結果更具敏感性[32]。Wang等在一項研究中提出在早期口腔癌唾液中檢測ctDNA敏感性為100%[33]。

ctDNA的關鍵在于其反應原發腫瘤的特異性基因組改變：包括體細胞突變、拷貝數改變、染色體易位、表觀遺傳改變等[34-35]。多項研究表明，與健康對照組相比，口腔癌患者的唾液中ctDNA水平升高。ctDNA的存在可以通過轉染健康細胞促進癌癥演變發展[36]。除此之外，研究發現異常的ctDNA甲基化與惡性腫瘤分級和淋巴節轉移相關[37]。近年來隨著ctDNA研究的不斷增多，提示唾液ctDNA檢測可用于口腔癌的早期診斷和腫瘤復發的監測[34]。

3 唾液外泌體中的蛋白質標志物

蛋白是參與口腔癌生長、凋亡和轉移病理過程的重要分子，口腔癌細胞或宿主細胞分泌的激素、抗體、酶和細胞因子等蛋白不僅提供了口腔癌的全面病理信息，而且被認為是口腔癌非侵入性篩查的潛在靶點[35]。隨著分析高通量技術的進步，極大地提高了唾液蛋白質組學生物標志物檢測的靈敏性和特異性。

一些研究已經在唾液外泌體中檢測到了一系列有關口腔癌的潛在標志物。Winck等用LC-MS/MS和無標簽蛋白定量分析(label-free protein quantification，LFQ)了OSCC患者和健康個體的全唾液和唾液細胞外囊泡蛋白質組，細胞外囊泡的蛋白質在健康和口腔癌組之間具有顯著的差異豐度，A2M、HPa、MUC5B、LGALS3BP、IGHA1、PIP、PKM1/M2、GAPDH有望成為口腔癌潛在的蛋白生物標志物[38]。外泌體四跨膜蛋白如CD63、CD9和CD81在生物分子的分類、選擇性募集、靶點選擇、細胞特異性進入、捕獲、血管生成和血管生成等方面起著至關重要的作用[39]。Zlotogorski-Hurvitz等[40]報道了口腔癌患者唾液內外泌體濃度和平均體積均高于健康人群，且從口腔癌患者唾液中分離的外泌體四跨膜蛋白(CD63、CD9 和CD81)的表達與健康個體存在差異，即CD81 和CD9水平降低，CD63水平升高。這可以作為口腔癌的診斷標志，甚至是在疾病早期階段也能幫助檢測出不易被發現的口腔癌。

4 發展與展望

唾液外泌體在細胞間通信、免疫調節、炎癥反應、細胞分化及凋亡、腫瘤細胞生長及轉移、腫瘤細胞凋亡等方面發揮重要作用[41]。由于唾液來源的外泌體內容物反映人體病理狀態，且具有穩定的特性，使得唾液外泌體能夠成為一種安全、無創篩查口腔癌的理想標記物。唾液外泌體的出現無疑為實驗室研究和臨床應用提供了新的方向，然而唾液外泌體的檢測技術和方法還需要進一步發展，在口腔癌中的生物學、作用機制有待進一步研究，應用的可靠性和有效性暫不明確，這將是未來亟待解決的問題。