LRRK2 G2385R和 GBA L444P雙突變對帕金森疾病臨床表型的影響

任靜靜 王珊珊 郭戰萍

河南省新鄉市中心醫院 453700

帕金森病(Parkinson’s disease，PD)是常見的中樞神經系統退行性疾病，大量文獻顯示PD與遺傳因素密切相關，且GBA、LRRK2是重要的生物標志物[1-3]。臨床研究提出LRRK2突變與散發型PD存在密切聯系[4]。Gan-Or Z研究顯示在猶太人中攜帶 GBA 突變使其發展為PD的危險性增加13倍[5]。但目前關于上述生物標志物對PD的病情評估的報道較少，且關于即攜帶LRRK2 G2385R又攜帶GBA L444P PD患者的臨床過程和特征尚未報道，本實驗檢測LRRK2 G2385R、GBA L444P雙基因型突變分布情況，探討LRRK2 G2385R和 GBA L444P突變對PD疾病臨床表型的影響。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選擇2017年4月—2019年1月在我院診療的PD患者416例，其中男199例，女217例，所有PD患者均符合英國帕金森病協會腦庫診斷標準，年齡40～80歲，排除由藥物、創傷、腦血管病等誘發的PD以及有PD家族史者，排除軀體和器質性病變以及除PD外其他神經系統疾病。

1.2 LRRK2 G2385R和GBA L444P檢測

1.2.1 提取DNA：抽取2ml空腹靜脈血至 EDTA-Na2抗凝管，于-20℃冰箱保存，采用上海百傲科技股份有限公司血液基因組DNA提取試劑盒，按操作步驟提取DNA。

1.2.2 LRRK2 G2385R多態性測定：根據NCBI及ensembl基因庫中LRRK2 G2385R所在的DNA序列，設計上游引物：5’-TTGCTAAGCAAAATAGCCCTG-3’和下游引物5’-GTAATGCTTCTCAGCACCATCTT-3’。 PCR 反應體系 25μl。反應條件：94℃ 5min，再94℃ 30s，61℃ 45s，72℃ 60s，共30個循環后，72℃ 5min 終止反應。PCR產物純化后轉移到專用孔板進行測序反應，引物同上濃度稀釋10倍，反應體系10μl，反應條件：96℃ 1min，再96℃ 10s，50℃ 5s，60℃ 4s，共25個循環后，60℃ 4min 終止反應。純化測序產物后在3500DX Genetic Analyzer儀器上檢測基因序列。擴增試劑、測序試劑及純化試劑均采用美國應用生物系統公司。

1.2.3 GBA L444P多態性測定：上游引物5’AATTGGGTGCGTAACTTTGTC-3’和下游引物5’-CAATGGTGAGGTGGGAAGT -3’，其余同上。

1.3 統計學方法 應用 SPSS20.0軟件統計學分析數據，計數資料采用Fisher 精確檢驗，計量資料采用F檢驗。P<0.05差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 LRRK2基因G2385R位點及GBA基因L444P位點序列測定 詳見圖1、2。

圖1 GBA雜合突變測序圖

圖2 LRRK2雜合突變測序圖

2.2 研究對象的LRRK2 G2385R及GBA L444P多態性分布 本實驗研究對象中檢測出32例LRRK2 基因 G2385RG/A的雜合子突變(突變率7.69%)，8例GBA 基因 L444PT/C的雜合子突變(突變頻率1.92%)，4例攜帶LRRK2 G2385R及GBA L444P雙基因突變(突變率0.96%),均未檢測出基因純合突變。

2.3 一般資料 根據上述2個基因檢測結果分為4組：僅攜帶LRRK2 G2385R突變的LRRK2-PD組、僅攜帶GBA L444P突變的GBA-PD組、攜帶LRRK2 G2385R和 GBA L444P雙基因突變的LRRK2-GBA-PD組和未攜帶LRRK2 G2385R或 GBA L444P突變的MNPD組，在性別上4組間差異無統計學意義(P>0.05)。首發年齡LRRK2-PD組明顯晚于GBA-PD組、LRRK2-GBA-PD組和MNPD組，差異具有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 4組患者一般資料對比

2.4 4組患者的臨床特征 4組在震顫為首發癥狀的差異無統計學意義(P>0.05)。LRRK2-PD組、GBA-PD組、LRRK2-GBA-PD組和MNPD組在疾病的分級、睡眠障礙、癡呆方面的差異有統計學意義(P<0.05)，見表2。

表2 4組患者臨床特征對比[n(%)]

3 討論

PD是以震顫、運動遲緩、肌強直和姿勢步態異常等常見的臨床特征，也可伴睡眠障礙、癡呆并發癥等。PD多發于老年，確切病因尚未清楚，有相關研究指出，其病因與發病機制可能與遺傳、環境及衰老等因素有關[6]，但鮮有報道多基因位點對疾病進展的預測，為此本研究采用一代測序檢測我院416例PD患者的LRRK2 G2385R、GBA L444P突變情況，探討LRRK2 G2385R和 GBA L444P突變對PD臨床表型的影響。

本實驗檢測出36例LRRK2 基因 G2385RG/A和12例GBA 基因 L444PT/C且均為雜合突變。這與相關學者報道的大陸，臺灣變異頻率基本一致[7-10]。驗證了LRRK2 G2385R、GBA L444P相關PD易感基因為國內PD人群中常見的基因突變類型。本實驗攜帶GBA基因L444PT/C突變率為1.92%，突變率較低提示除此易感基因外，可能存在其他因素修飾并參與PD疾病的發生。近年來，隨著科研人員在基因方面研究不斷地深入，發現基因多態位點的相互作用可以導致許多疾病患病風險[11]，本次研究首次檢測出發現4例既攜帶LRRK2 G2385R又攜帶GBA L444P突變的PD患者，提示PD也存在多基因位點的相互作用。

進一步分析LRRK2 G2385R、GBA L444P突變與臨床表型的相關性，筆者發現LRRK2-PD組、GBA-PD組、LRRK2-GBA-PD組和MNPD組在性別上無顯著差異，這不同于Wang C等[12]提出的內地PD 患者LRRK2 基因突變攜帶者以男性居多，也與之前研究顯示攜帶 GBA 基因突變PD 患者在男性中居多的結果不一致[13]，考慮這是由于不同樣本量問題造成誤差和偏倚的結果。在起病年齡方面，LRRK2-PD組較其他組的起病年齡明顯晚，這與相關研究相同[14]；說明LRRK2突變影響PD的發病時間。4組在震顫為首發癥狀上并無統計學差異，也與之前的研究吻合[15]，這指示出震顫是PD的常見的首發表現，個體差異性不大。LRRK2-PD組與其他組相比癥狀較重進展較快且更易出現睡眠障礙、癡呆，這與報道的攜帶LRRK2 G2385R的患者日常生活能力和軸性癥狀的進展較快、睡眠障礙進展更迅速、認知功能差的結論一致[16]。說明攜帶LRRK2突變的PD病例進展快癥狀重且傾向出現睡眠及認知障礙的并發癥，這在臨床試驗的分層研究中意義重大，可通過LRRK2 G2385R突變來預測PD個體化進展轉歸。攜帶GBA 基因突變組者并沒有出現之前國外研究報道的明顯年輕化[17]，這些結果的差異可能與人群環境不同有關，同時需要今后擴大樣本量進一步驗證。實驗還驚奇發現LRRK2-GBA-PD組即攜帶LRRK2 G2385R又攜帶GBA L444P PD患者沒有出現睡眠障礙、癡呆等癥狀；且與LRRK2-PD組相比疾病嚴重分級更低，與MNPD組相比不易出現癡呆，并沒有出現理論假設的雙突變患者癥狀表現更嚴重的。這可能意味著GBA L444P突變與LRRK2 G2385R突變并沒有協同作用而具有反向相關性。即GBA L444P突變對攜帶LRRK2 G2385R PD患者有一定的阻止疾病惡性進展的保護作用。但由于本實驗的LRRK2-GBA-PD的稀缺及疾病本身會受多因素的影響，需要進一步擴大樣本量排除多因素的干擾來驗證該結論，進一步深入了解GBA L444P基因突變可能有助于研發干預疾病發展的手段。

綜上所述，攜帶LRRK2 G2385R突變 PD患者的首發年齡晚、但病程進展快、有較高的睡眠障礙和癡呆率，可作為預測PD的進展轉歸。GBA L444P基因突變對攜帶LRRK2 G2385R突變的PD患者有一定的保護作用，GBA L444P基因突變可能在延緩PD進展方面起重要作用。