白毛烏蘞莓化學成分及抗類風濕性關節炎活性研究

彭伊玲，張在其，李明姣，余黃合,姚 旺，易剛強，李 斌*，王 煒

1湖南中醫藥大學藥學院 中醫藥民族醫藥國際聯合實驗室，長沙 410208；2湖南醫藥學院侗藥湖南省重點實驗室，懷化 418000

白毛烏蘞莓隸屬于葡萄科(Vitaceae)烏蘞莓屬(CayratiaJuss)，該屬約45種，廣泛分布于亞洲，非洲及大洋洲等世界各地，中國約有16種，主要分布在我國江西、浙江、福建、湖北、湖南、廣東、廣西、四川、貴州、云南等地區，生于海拔300～2 000 m的山谷林中或山坡巖石上[1]。烏蘞莓屬植物通常具有清熱解毒，活血散瘀，利尿的功效，在民間多被用于咽喉腫痛、痢疾、癰腫、跌打腫痛、毒蛇咬傷等證的治療，也常被用于治療風濕性疾病、泌尿系統感染、口腔皰疹等疾病[2]?，F代藥理研究顯示烏蘞莓屬植物具有抗菌、抗炎、抗病毒和抗腫瘤活性，本屬植物主要含有黃酮類、甾體、脂類、萜類、揮發油等化學成分[3,4]。在湖南湘西北侗族聚居區，由于復雜的地勢環境和獨特的氣候環境，使得侗族人民在與自然環境和疾病的斗爭中積累了豐富的用藥經驗，并形成了獨特的侗醫藥體系。白毛烏蘞莓作為常用侗藥，被稱為“教美姑”或“教眉庫”，其干燥地上部分被長期用于治療類風濕性關節炎，療效確切，具有很大的開發前景，但目前尚未查到白毛烏蘞莓化學成分與現代藥理活性研究的相關報道。為了更合理地開發利用該植物資源，充分發揮其藥用價值，本實驗對其化學成分及體外抗類風濕性關節炎活性作用開展了研究，以期為白毛烏蘞莓的進一步開發和臨床應用提供有利的科學參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

N-1300旋轉蒸發儀(上海愛朗儀器有限公司)；6470LC/TQ型質譜儀(安捷倫公司)；BRUKER-600超導核磁共振儀(Bruker公司)；HAD496酶標儀(北京恒奧德儀器有限公司)；Micro17R高速冷凍離心機(賽默飛世爾科技有限公司)；AL204分析天平(瑞士蘇黎世的梅特勒-托利多集團)；二氧化碳細胞培養箱(賽默飛世爾科技有限公司)。

薄層色譜硅膠G、GF254、柱色譜硅膠(100～200目，200～300目)(青島海洋化工廠)；葡聚糖凝膠SephadexTMLH-20(瑞典GE Healthcare Bio-Sciences AB公司)；石油醚、環己烷、二氯甲烷、氯仿、乙酸乙酯、乙醇、甲醇(分析純，國藥集團化學試劑有限公司)；二甲基亞砜、DMEM/F-12培養基、DMEM高糖培養基、胎牛血清、PBS、LPS、吲哚美辛(北京索萊寶科技有限公司)；胰酶細胞消化液(上海碧云天生物技術有限公司)；小鼠TNF-α、IL-1β、IL-6炎癥因子Elisa試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)；RAFLS細胞、RAW 264.7細胞(北京北納創聯生物技術研究有限公司)。

1.2 植物材料

白毛烏蘞莓于2017年9月采集于湖南省懷化市通道侗族自治縣，經湖南中醫藥大學藥用植物學教研室王智鑒定為葡萄科烏蘞莓屬植物白毛烏蘞莓(CayratiaalbifoliaC.L.Li)。植物標本(20170923)現存放在湖南醫藥學院侗藥湖南省重點實驗室。

1.3 提取與分離

白毛烏蘞莓干燥地上部分(1 500.00 g)經粉碎后用75%的乙醇滲漉提取，在小于60 ℃的溫度下用旋轉蒸發儀進行減壓濃縮，得到460.00 g干燥浸膏。取其中235.00 g干燥浸膏于700 mL水中分散，依次用石油醚，二氯甲烷，乙酸乙酯，正丁醇萃取。萃取后浸膏分別干燥稱重得：石油醚層浸膏(12.86 g)，二氯甲烷層浸膏(12.04 g)，乙酸乙酯層浸膏(4.57 g)，正丁醇層浸膏(25.85 g)。

石油醚層浸膏(12.86 g)拌入19.00 g硅膠(200～300目)，攪拌均勻干燥后，經硅膠柱色譜(硅膠柱8 cm × 60 cm)用石油醚-乙酸乙酯系統(20∶1→15∶1→10∶1→4∶1→2∶1)梯度洗脫，以5%硫酸香草醛作為顯色劑在TLC上檢識，合并后得到14個流分，記為Fr. A～Fr. N。Fr. E流分(2.00 g)用硅膠柱色譜以石油醚-乙酸乙酯(9∶1)系統等度洗脫，得到8個流分Fr. E-1～Fr. E-8，Fr. E-1通過硅膠柱色譜和葡聚糖凝膠Sephadex LH-20柱色譜反復分離，從中分離得到化合物2(10.0 mg)和化合物19(143.8 mg)。Fr. F流分(814.9 mg)用硅膠柱色譜以石油醚-乙酸乙酯(6∶1→5∶1)系統梯度洗脫，得到兩個流分Fr. F-1和Fr. F-2；Fr. F-1用硅膠柱色譜以石油醚-乙酸乙酯(10∶1)系統等度洗脫，得到化合物1(52.6 mg)；Fr. F-2用硅膠柱色譜以氯仿-乙酸乙酯(30∶1)系統等度洗脫，得到化合物3(348.6 mg)。Fr. H流分(99.1 mg)先經硅膠柱色譜以氯仿-丙酮系統(10∶1)系統等度洗脫，再經葡聚糖凝膠Sephadex LH-20柱色譜分離，洗脫體系為石油醚-氯仿-甲醇(4∶5∶1)，從中分離得到化合物5(4.9 mg)和化合物15(2.7 mg)。Fr. L流分(209.6 mg)用硅膠柱色譜以二氯甲烷-甲醇(1∶0→99∶1→19∶1)系統梯度洗脫，從中分離得到化合物17(20.9 mg)。Fr. N流分(335.1 mg)經硅膠柱色譜以二氯甲烷-甲醇(1∶0→20∶1→10∶1)系統梯度洗脫，得到三個流分Fr. N-1～Fr. N-3；Fr. N-2流分經重結晶純化后得到化合物4(119.3 mg)，Fr. N-3經硅膠柱色譜和葡聚糖凝膠Sephadex LH-20柱色譜反復分離，從中分離得化合物11(2.1 mg)。

乙酸乙酯層浸膏(4.57 g)拌入6.00 g硅膠(200～300目)，攪拌均勻干燥后，經硅膠柱色譜(硅膠柱4 cm × 60 cm)用氯仿-甲醇系統(1∶0→19∶1→9∶1→17∶3→4∶1→3∶1)梯度洗脫，用5%硫酸香草醛作為顯色劑在TLC上檢識，合并得到12個流分，記為Fr. Y-A～Fr. Y-L。Fr. Y-A流分(173.1 mg)通過葡聚糖凝膠Sephadex LH-20柱色譜分離，洗脫體系為石油醚-氯仿-甲醇(4∶5∶1)，從中得到化合物3(50.0 mg)。Fr. Y-B流分(93.3 mg)用硅膠柱色譜分離，純氯仿洗脫，從中分離得到化合物18(63.4 mg)。Fr. Y-D流分(45.0 mg)通過凝膠柱色譜分離，洗脫體系為石油醚-氯仿-甲醇(4∶5∶1)，從中分離得到化合物9(10.0 mg)。Fr. Y-E流分(126.7 mg)用硅膠柱色譜以環己烷-乙酸乙酯(1∶1→1∶3)系統梯度洗脫，從中分離得到化合物16(28.1 mg)。Fr. Y-G流分(216.4 mg)用硅膠柱色譜以環己烷-乙酸乙酯(1∶1→1∶3)系統梯度洗脫后，再經硅膠柱色譜和葡聚糖凝膠柱色譜反復分離，從中分離得到化合物6(3.3 mg)，化合物12(3.0 mg)和化合物14(50.7 mg)。Fr. Y-H流分(89.1 mg)經硅膠柱色譜以環己烷-乙酸乙酯(1∶2→1∶4)系統梯度洗脫得到兩個流分Fr. Y-H-1和Fr. Y-H-2，其中Fr. Y-H-2經葡聚糖凝膠Sephadex LH-20柱色譜以石油醚-氯仿-甲醇(4∶5∶1)體系等度洗脫，從中分離得到化合物13(1.9 mg)。Fr. Y-L流分(147.3 mg)用硅膠柱色譜以乙酸乙酯-甲醇(1∶0→20∶1)系統梯度洗脫，再經硅膠柱色譜和葡聚糖凝膠柱色譜反復分離，從中分離得到化合物10(3.5 mg)和20(1.0 mg)。Fr. Y-O流分(127.6 mg)用硅膠柱色譜以乙酸乙酯-甲醇(10∶1)系統等度洗脫后，再經硅膠柱色譜和葡聚糖凝膠Sephadex LH-20柱色譜反復分離，從中分離得到化合物7和化合物8(22.9 mg)。

1.4 化合物抗RAFLS增殖

取對數生長期生長良好的類風濕關節炎成纖維樣滑膜(rheumatoid arthritis fibroblast-like synoviocytes，RAFLS)細胞，移除原培養基，用1 × PBS清洗2次，每個培養皿加入含0.02% EDTA的胰酶消化液500 μL于5% CO2，37 ℃的培養箱中消化2 min，再加入500 μL 10% FBS的DMEM/F-12培養基終止消化，充分混勻后，轉移至1 mL EP管中，以800 r/min離心5 min，計數，調節細胞密度為1 × 104個/mL種植于96孔板，100 μL/孔恒溫箱中37 ℃培養24 h。化合物1～20用DMSO 5 mM濃度的母液，再加DMEM培養基分別稀釋至500 μmol/L備用。除對照組(吲哚美辛)及空白孔外，其余各組加入各化合物使其在100 μL體系終濃度為0、1、2、4、6、8、16、20 μmol/L，處理48 h后，每孔加入含有10% MTT的DMEM溶液(5 mg/mL)100 μL，37 ℃繼續孵育4 h后，小心移除孔內培養上清液，每孔加入100 μL DMSO在搖床上避光震蕩10 min，使結晶物充分溶解。選擇490 nm波長，在酶標儀上測定各孔光吸收值(OD)。記錄各組的OD值，并按公式(1)計算各化合物對RAFLS細胞的IC50值。

(1)

1.5 化合物抗LPS誘導的RAW 264.7細胞炎癥因子生成

取對數生長期生長良好的RAW 264.7細胞，移除原培養基，用1 × PBS清洗2次，每個培養皿加入含0.02% EDTA的胰酶消化液500 μL，于5% CO237 ℃的培養箱中消化2 min，再加入500 μL 10% FBS的DMEM培養基終止消化，充分混勻后，轉移至1 mL EP管中，以800 r/min離心5 min，計數，調節細胞密度為1 × 104個/mL種植于96孔板，100 μL/孔恒溫箱中37 ℃培養24 h。除對照組(吲哚美辛)及空白孔外，其余各組加入各化合物使其在100 μL體系終濃度為0、1、2、4、6、8、16、20 μmol/L，藥物處理后的第44 h，每孔加入LPS，使其在100 μL體系終濃度為100 ng/mL，繼續放置培養箱中培養4 h，得到細胞上清液待測。用ELISA試劑盒嚴格按照說明書檢測各孔上清液中含有的炎性因子濃度。最后在450 nm波長條件下依序讀取各孔的OD值。根據公式(2)進行計算出各個化合物對各種炎性因子的IC50值。

(2)

2 結果

2.1 結構鑒定

化合物1無定型粉末(CHCl3)；ESI-MS：m/z451 [M+Na]+；1H NMR(600 MHz，CDCl3)δ：0.96(3H，s，H-19)，0.93(3H，d，J=6.5 Hz，H-21)，0.86(3H，s，H-29)，0.84(3H，d，J=8.2 Hz，H-26)，0.81(3H，d，J=8.2 Hz，H-27)，0.69(3H，s，H-18)；13C NMR(150 MHz，CDCl3)δ：38.3(C-1)，39.5(C-2)，209.3(C-3)，37.2(C-4)，57.7(C-5)，211.5(C-6)，46.8(C-7)，37.6(C-8)，53.6(C-9)，41.4(C-10)，21.8(C-11)，38.2(C-12)，43.2(C-13)，56.2(C-14)，24.2(C-15)，28.2(C-16)，56.8(C-17)，12.7(C-18)，12.2(C-19)，36.2(C-20)，18.9(C-21)，34.0(C-22)，26.2(C-23)，45.9(C-24)，29.3(C-25)，20.0(C-26)，19.2(C-27)，23.1(C-28)，12.1(C-29)。以上數據與文獻[5]報道基本一致，故鑒定該化合物為豆甾-3,6-二酮。

化合物2無定型粉末(CHCl3)；ESI-MS：m/z413 [M+H]+；1H NMR(600 MHz，CDCl3)δ：5.72(1H，br s，H-4)，1.18(3H，s，H-19)，0.92(3H，d，J=6.5 Hz，H-21)，0.84(3H，d，J=7.0 Hz，H-29)，0.83(3H，d，J=6.5 Hz，H-26)，0.81(3H，d，J=6.8 Hz，H-27)，0.71(3H，s，H-18)；13C NMR(150 MHz，CDCl3)δ：35.8(C-1)，34.1(C-2)，199.8(C-3)，123.9(C-4)，171.9(C-5)，33.1(C-6)，32.2(C-7)，35.8(C-8)，54.0(C-9)，38.7(C-10)，21.2(C-11)，39.8(C-12)，42.5(C-13)，56.0(C-14)，24.3(C-15)，28.3(C-16)，56.1(C-17)，12.1(C-18)，17.5(C-19)，36.3(C-20)，18.8(C-21)，34.0(C-22)，26.2(C-23)，46.0(C-24)，29.3(C-25)，20.0(C-26)，19.2(C-27)，23.2(C-28)，12.1(C-29)。以上數據與文獻[6]報道基本一致，故鑒定該化合物為豆甾-4-烯-3-酮。

化合物3白色針狀結晶(CHCl3)；ESI-MS：m/z437 [M+Na]+；1H NMR(600 MHz，CDCl3)δ：5.38(1H，br s，H-6)，1.03(3H，s，H-19)，0.95(3H，d，J=6.5 Hz，H-21)，0.89(3H，m，H-26)，0.88～0.86(3H，m，H-29)，0.83(3H，d，J=6.8 Hz，H-27)，0.70(3H，s，H-18)；13C NMR(150 MHz，CDCl3)δ：37.4(C-1)，31.8(C-2)，72.0(C-3)，42.5(C-4)，140.9(C-5)，121.9(C-6)，32.1(C-7)，32.1(C-8)，50.3(C-9)，36.7(C-10)，21.2(C-11)，39.9(C-12)，42.5(C-13)，56.9(C-14)，24.5(C-15)，28.4(C-16)，56.2(C-17)，12.0(C-18)，19.6(C-19)，36.3(C-20)，18.9(C-21)，34.1(C-22)，26.2(C-23)，46.0(C-24)，29.3(C-25)，20.0(C-26)，19.2(C-27)，23.2(C-28)，12.1(C-29)。以上數據與文獻[7]報道基本一致，故鑒定該化合物為β-谷甾醇。

化合物4白色無定型粉末(CHCl3)；ESI-MS：m/z599 [M+Na]+；1H NMR(600 MHz，C5D5N)δ：5.37(1H，br s，H-6)，5.08(1H，d，J=7.7 Hz，H-1′)，1.01(3H，s，H-19)，0.95(3H，d，J=6.5 Hz，H-21)，0.93～0.91(3H，m，H-29)，0.90(3H，m，H-26)，0.88(3H，d，J=6.8 Hz，H-27)，0.68(3H，s，H-18)；13C NMR(150 MHz，C5D5N)δ：37.9(C-1)，30.7(C-2)，78.5(C-3)，39.7(C-4)，141.3(C-5)，122.3(C-6)，32.6(C-7)，32.5(C-8)，50.7(C-9)，37.3(C-10)，21.7(C-11)，40.4(C-12)，42.9(C-13)，57.2(C-14)，24.9(C-15)，29.0(C-16)，56.6(C-17)，12.4(C-18)，19.4(C-19)，36.8(C-20)，19.6(C-21)，34.6(C-22)，26.8(C-23)，46.4(C-24)，29.9(C-25)，19.8(C-26)，20.4(C-27)，23.8(C-28)，12.6(C-29)，103.0(C-1′)，75.8(C-2′)，79.0(C-3′)，72.1(C-4′)，78.9(C-5′)，63.2(C-6′)。以上數據與文獻[8]報道基本一致，故鑒定該化合物為β-D-胡蘿卜苷。

化合物5無定型粉末(CHCl3)；ESI-MS：m/z479 [M+Na]+；1H NMR(600 MHz，DMSO-d6)δ：4.68(1H，s，H-29α)，4.58(1H，br s，H-29β)，1.64(3H，s，H-30)，0.93(3H，s，H-24)，0.87(3H，s，H-27)，0.86(3H，s，H-26)，0.76(3H，s，H-23)，0.64(3H，s，H-25)；13C NMR(150 MHz，DMSO-d6)δ：38.0(C-1)，26.9(C-2)，76.5(C-3)，38.2(C-4)，54.6(C-5)，17.7(C-6)，33.6(C-7)，40.0(C-8)，49.6(C-9)，36.4(C-10)，20.2(C-11)，24.8(C-12)，37.3(C-13)，41.7(C-14)，29.8(C-15)，31.4(C-16)，55.1(C-17)，46.3(C-18)，48.2(C-19)，150.0(C-20)，28.9(C-21)，36.0(C-22)，27.8(C-23)，15.4(C-24)，15.5(C-25)，15.7(C-26)，14.1(C-27)，176.9(C-28)，109.4(C-29)，18.7(C-30)。以上數據與文獻[9]報道基本一致，故鑒定該化合物為白樺脂酸。

化合物6無色針狀結晶(MeOH)；ESI-MS：m/z227 [M-H]-；1H NMR(600 MHz，CD3OD)δ：7.35(2H，d，J=8.5 Hz，H-2′，6′)，6.97(1H，d，J=16.2 Hz，H-8)，6.81(1H，d，J=16.2 Hz，H-7)，6.77(2H，d，J=8.5 Hz，H-3′，5′)，6.44(2H，d，J=2.1 Hz，H-2，6)，6.16(1H，t，J=2.1 Hz，H-4)；13C NMR(150 MHz，CD3OD)δ：141.3(C-1)，105.7(C-2)，159.7(C-3)，102.6(C-4)，159.7(C-5)，105.7(C-6)，127.0(C-7)，129.4(C-8),130.4(C-1′)，128.8(C-2′)，116.5(C-3′)，158.4(C-4′)，116.5(C-5′)，128.8(C-6′)。以上數據與文獻[10]報道基本一致，故鑒定該化合物為白藜蘆醇。

化合物7白色粉末(MeOH)；ESI-MS：m/z413 [M+Na]+；1H NMR(600 MHz，CD3OD)δ：7.35(2H，d，J=8.5 Hz，H-2′，6′)，7.02(1H，d，J=16.2 Hz，H-8)，6.85(1H，d，J=16.2 Hz，H-7)，6.79(1H，t，J=2.1 Hz，H-2)，6.76(2H，d，J=8.5 Hz，H-3′，5′)，6.61(1H，t，J=2.1 Hz，H-6)，6.44(1H，t，J=2.1 Hz，H-4)，4.88(1H，d，J=7.2 Hz，H-1′′)；13C NMR(150 MHz，CD3OD)δ：141.5(C-1)，108.4(C-2)，160.5(C-3)，104.1(C-4)，159.6(C-5)，107.0(C-6)，126.7(C-7)，130.0(C-8)，130.4(C-1′)，128.9(C-2′，6′)，116.5(C-3′，5′)，158.5(C-4′)，102.5(C-1′′)，75.0(C-2′′)，78.1(C-3′′)，71.5(C-4′′)，78.3(C-5′′)，62.6(C-6′′)。以上數據與文獻[11]報道基本一致，故鑒定該化合物為反式白藜蘆醇苷。

化合物8白色粉末(MeOH)；ESI-MS：m/z413 [M+Na]+；1H NMR(600 MHz，CD3OD)δ：7.08(2H，d，J=8.5 Hz，H-2′，6′)，6.64(2H，d，J=8.5 Hz，H-3′，5′)，6.52(1H，br s，H-2)，6.46(1H，d，J=12.2 Hz，H-8)，6.39～6.37(2H，m，H-4，6)，6.35(1H，d，J=12.2 Hz，H-7)，4.68(1H，d，J=7.2 Hz，H-1′′)；13C NMR(150 MHz，CD3OD)δ：141.1(C-1)，109.2(C-2)，160.1(C-3)，103.9(C-4)，159.4(C-5)，111.1(C-6)，129.1(C-7)，131.4(C-8)，129.9(C-1′)，131.4(C-2′，6′)，116.1(C-3′，5′)，157.8(C-4′)，102.3(C-1′′)，74.8(C-2′′)，78.0(C-3′′)，71.1(C-4′′)，77.8(C-5′′)，62.2(C-6′′)。以上數據與文獻[12]報道基本一致，故鑒定該化合物為順式白藜蘆醇苷。

化合物9淡黃色粉末(CHCl3)；ESI-MS：m/z160 [M-H]-；1H NMR(600 MHz，C5D5N)δ：13.03(1H，s，-COOH)，8.91(1H，d，J=7.9 Hz，H-4)，8.55(1H，d，J=2.8 Hz，H-2)，7.65(1H，br d，J=8.1 Hz，H-7)，7.45(1H，ddd，J=8.1，7.0，1.1 Hz，H-5)，7.36(1H，td，J=8.1，7.0，1.1 Hz，H-6)；13C NMR(150 MHz，C5D5N)δ：168.2(COOH)，133.2(C-2)，110.2(C-3)，122.5(C-4)，122.1(C-5)，123.2(C-6)，113.0(C-7)，138.2(C-8)，128.1(C-9)。以上數據與文獻[13]報道基本一致，故鑒定該化合物為1H-吲哚-3-羧酸。

化合物10白色粉末(MeOH)；ESI-MS：m/z245 [M+H]+；1H NMR(600 MHz，C5D5N)δ：6.86(1H，dd，J=15.9，0.9 Hz，H-7)，6.53(1H，dd，J=15.9，6.1 Hz，H-8)，4.93(1H，ddd，J=15.7，10.2，4.3 Hz，H-3)，4.79(1H，p，J=6.1 Hz，H-9)，2.61(1H，t，J=11.9 Hz，H-2β)，2.51(1H，ddd，J=12.2，4.2，2.0 Hz，H-4α)，2.49(1H，t，J=11.9 Hz，H-2α)，2.07(1H，ddd，J=12.2，4.2，2.0 Hz，H-4β)，1.69(3H，s，H-12)，1.69(3H，s，H-13)，1.52(3H，d，J=6.4 Hz，H-10)，1.29(3H，s，H-11)；13C NMR(150 MHz，C5D5N)δ：40.3(C-1)，47.1(C-2)，64.1(C-3)，46.9(C-4)，76.9(C-5)，78.4(C-6)，130.4(C-7)，136.4(C-8)，68.2(C-9)，24.9(C-10)，27.7(C-11)，26.3(C-12)，27.7(C-13)。以上數據與文獻[14]報道基本一致，故鑒定該化合物為 (3S,5R,6S,7E)-megastigma-7-ene-3,5,6,9-tetrol。

化合物11無定型粉末(MeOH)；ESI-MS：m/z231 [M+Na]+；1H NMR(600 MHz，C5D5N)δ：4.83(1H，d，J=7.8 Hz，H-1)，4.05(1H，t，J=8.2 Hz，H-2)，4.26～4.29(1H，m，overlap，H-3)，4.23～4.26(1H，m，overlap，H-4)，3.96(1H，m，H-5)，4.57(1H，dd，J=11.8，2.1 Hz，H-6α)，4.39(1H，dd，J=11.8，5.5 Hz，H-6β)，3.69(1H，dq，J=9.4，7.0 Hz，H-1′α)，4.10(1H，dq，J=9.4，7.0 Hz，H-1′β)，1.19(3H，t，J=7.1 Hz，H-2′)；13C NMR(150 MHz，C5D5N)δ：105.9(C-1)，75.4(C-2)，78.8(C-3)，71.9(C-4)，78.7(C-5)，63.0(C-6)，65.2(C-1′)，15.8(C-2′)。以上數據與文獻[15]報道基本一致，故鑒定該化合物為乙基-β-D-吡喃葡萄糖苷。

化合物12無定型粉末(MeOH)；ESI-MS：m/z241 [M+K]+；1H NMR(600 MHz，C5D5N)δ：6.23(1H，s，H-2)，2.77(1H，m，H-4α)，3.76(1H，d，J=12.3 Hz，H-6)，2.46(1H，m，H-4β)，2.42(3H，s，3-CH3)，2.13(1H，m，H-5α)，1.86(1H，m，H-5β)，1.52(1H，s，H-8)，1.48(3H，s，7-CH3)；13C NMR(150 MHz，C5D5N)δ：169.7(C-1)，117.9(C-2)，159.8(C-3)，39.1(C-4)，30.7(C-5)，78.5(C-6)，72.9(C-7)，26.4(C-8)，19.2(3-CH3)，26.2(7-CH3)。以上數據與文獻[16]報道基本一致，故鑒定該化合物為6,7-二羥基-3,7-二甲基-2-辛烯酸。

化合物13無定型粉末(MeOH)；ESI-MS：m/z155 [M+Na]+；1H NMR(600 MHz，C5D5N)δ：5.00(1H，m，H-4)，4.91(1H，m，H-5)，4.13(1H，dd，J=12.2，3.4 Hz，H-6α)，4.03(1H，dd，J=12.2，3.2 Hz，H-6β)，3.33(1H，dd，J=17.5，6.7 Hz，H-3α)，2.86(1H，dd，J=17.5，2.5 Hz，H-3β)；13C NMR(150 MHz，C5D5N)δ：177.0(C-2)，39.5(C-3)，69.2(C-4)，89.8(C-5)，62.1(C-6)。以上數據與文獻[17]報道基本一致，故鑒定該化合物為D-(+)-核糖酸-γ-內酯。

化合物14無定型粉末(MeOH)；ESI-MS：m/z153 [M-H]-；1H NMR(600 MHz，C5D5N)δ：8.37(1H，d，J=1.9 Hz，H-2)，8.10(1H，dd，J=8.2，1.8 Hz，H-6)，7.33(1H，d，J=8.2 Hz，H-5)；13C NMR(150 MHz，C5D5N)δ：123.3(C-1)，117.9(C-2)，146.7(C-3)，151.8(C-4)，115.9(C-5)，123.5(C-6)，169.1(C-7)。以上數據與文獻[18]報道基本一致，故鑒定該化合物為3,4-二羥基苯甲酸。

化合物15無色結晶(CHCl3)；ESI-MS：m/z133 [M+Na]+；1H NMR(600 MHz，CD3OD)δ：6.77～6.74(1H，m，H-4，5)，6.67～6.64(1H，m，H-3，6)；13C NMR(150 MHz，CD3OD)δ：146.3(C-1，2)，116.4(C-3，6)，120.9(C-4，5)。以上數據與文獻[19]報道基本一致，故鑒定該化合物為鄰苯二酚。

化合物16白色結晶型粉末(MeOH)；ESI-MS：m/z141[M-H]-；1H NMR(600 MHz，CD3OD)δ：7.87(2H，d，J=8.7 Hz，H-3，4)，6.80(2H，d，J=8.7 Hz，H-2，5)；13C NMR(150 MHz，CD3OD)δ：163.3(C-1，6)，116.0(C-2，5)，133.0(C-3，4)。以上數據與文獻[20]報道基本一致，故鑒定該化合物為己二烯二酸。

化合物17白色粉末(CHCl3)；ESI-MS：m/z355 [M+H]+；1H NMR(600 MHz，CDCl3)δ：5.41～5.31(4H，m，H-9,10,11,12,13)，4.21(1H，dd，J=11.7，4.5 Hz，H-1′α)，4.15(1H，dd，J=11.7，6.2 Hz，H-1′β)，3.93(1H，br s，H-2′)，3.70(1H，dd，J=11.4，3.5 Hz，H-3′α)，3.62(1H，dd，J=11.4，5.7 Hz，H-3′β)，2.79(2H，t，J=6.8 Hz，H-11)，2.37(2H，t，J=7.6 Hz，H-2)，2.09～2.01(4H，m，H-8，14)，1.66～1.61(2H，m，H-3)，1.38～1.25(14H，m，H-4～7，15，17)，0.91(3H，t，J=6.9 Hz，H-18)；13C NMR(150 MHz，CDCl3)δ：174.5(C-1)，34.3(C-2)，25.1(C-3)，29.2～29.7(C-4～7，15)，27.4(C-8)，128.2(C-9)，130.4(C-10)，25.8(C-11)，130.2(C-12)，128.0(C-13)，27.3(C-14)，31.7(C-16)，22.7(C-17)，14.2(C-18)，65.3(C-1′)，70.4(C-2′)，63.5(C-3′)。以上數據與文獻[21]報道基本一致，故鑒定該化合物為9,12-亞油酸-2′,3′-二羥基丙酯。

化合物18白色粉末(CHCl3)；ESI-MS：m/z321 [M+Na]+；1H NMR(600 MHz，CDCl3)δ：2.36(2H，t，J=7.5 Hz，H-2)，1.65(2H，p，J=7.5 Hz，H-3)，1.38～1.27(30H，m，H-4～18)，0.90(3H，t，J=7.0 Hz，H-19)；13C NMR(150 MHz，CDCl3)δ：179.9(C-1)，34.2(C-2)，24.8(C-3)，29.2～29.9(C-4～16)，32.1(C-17)，22.9(C-18)，14.3(C-19)。以上數據與文獻[22]報道基本一致，故鑒定該化合物為正十九烷酸。

化合物19白色粉末(CHCl3)；ESI-MS：m/z255 [M-H]-；1H NMR(600 MHz，CDCl3)δ：2.35(2H，t，J=7.5 Hz，H-2)，1.66～1.61(2H，p，J=7.5 Hz，H-3)，1.35～1.25(24H，m，H-4～15)，0.88(3H，t，J=7.0 Hz，H-16)；13C NMR(150 MHz，CDCl3)δ：179.9(C-1)，34.1(C-2)，24.8(C-3)，29.2～29.8(C-4～13)，32.1(C-14)，22.9(C-15)，14.3(C-16)。以上數據與文獻[23]報道基本一致，故鑒定該化合物為正十六烷酸。

化合物20白色粉末(CHCl3)；HRESI-MS：m/z295 [M-H]-；1H NMR(600 MHz，CD3OD)δ：7.97(1H，d，J=16.0 Hz，H-4)，6.38(1H，d，J=16.0 Hz，H-5)，5.86(1H，br s，H-2)，3.84(1H，tt，J=10.8，7.1 Hz，H-3′)，2.27(1H，ddd，J=14.2，7.0，1.5 Hz，H-2′α)，2.07(3H，s，3-CH3)，1.90(1H，ddd，J=13.5，7.0，1.5 Hz，H-4′α)，1.85(1H，dd，J=14.2，10.1 Hz，H-2′β)，1.73(1H，dd，J=13.5，11.1 Hz，H-4′β)，1.35(3H，s，1′-CH3)，1.09(3H，s，5′-CH3)；13C NMR(150 MHz，CD3OD)δ：171.0(C-1)，122.7(C-2)，147.5(C-3)，133.5(C-4)，131.1(C-5)，89.9(C-1′)，42.3(C-2′)，65.2(C-3′)，41.0(C-4′)，53.5(C-5′)，181.1(C-6′)，82.8(C-7′)，20.9(3-CH3)，18.5(1′-CH3)，14.5(5′-CH3)。以上數據與文獻[24]報道基本一致，故鑒定該化合物為rel-5-(3S,8S-dihydroxy-1R,5S-dimethyl-7-oxa-6-oxobicyclo[3,2,1]oct-8-yl)-3-methyl-2Z,4E-pentadienoic acid。

2.2 化合物抗RAFLS增殖活性

MTT法測試20個單體化合物對RA-FLS細胞增殖抑制活性結果顯示，化合物1、15、19和20對RA-FLS的增殖具有一定的抑制活性，但小于陽性對照藥物吲哚美辛，其IC50值分別為23.07、26.92、23.59及19.22 μmol/L。

2.3 化合物抗LPS誘導的RAW 264.7細胞炎癥因子生成活性

化合物抗LPS誘導的RAW 264.7細胞炎癥因子生成的影響結果顯示，化合物1、15、19和20均能抑制LPS誘導RAW 264.7細胞中炎性因子TNF-α生成，IC50值分別為13.58、18.51、13.45及9.58 μmol/L，化合物15和20能抑制LPS誘導RAW 264.7細胞中炎性因子IL-1β、IL-6的生成，其IC50值分別為13.56、17.30和14.42、8.71 μmol/L。

3 結論

侗藥“教美姑”在湖南湘西北侗族聚居區被長期用于治療類風濕性關節炎，療效確切，為了更合理地開發利用該植物資源，本文對其化學成分開展了研究，綜合運用多種色譜分離方法，從白毛烏蘞莓地上部分75%乙醇提取物中首次分離得到了20個化合物，并鑒定了它們的結構。其中除化合物3和4外，其他化合物均為首次從烏蘞莓屬植物中分離得到，進一步明確了白毛烏蘞莓的物質基礎。評價了各化合物對RAFLS細胞體外增殖抑制活性，及對LPS誘導RAW 264.7細胞中炎性因子TNF-α、IL-1β及IL-6生成的影響，發現部分化合物具有中等強度的抗炎活性，其活性可能與其抑制炎性因子的生成有關，但白毛烏蘞莓抗類風濕性關節炎的藥效物質基礎和作用機制還需通過系統的體內外實驗進一步深入研究。本文的研究結果可為白毛烏蘞莓的質量標準提升、進一步開發和臨床應用提供一定的實驗依據。