FAM20C在小鼠下頜髁突發育過程中的時空表達

祁 皓，馬 肅,2，袁朝陽，吳國棟，劉培紅,2

下頜髁突軟骨(mandibular condylar cartilage，MCC)是覆蓋下頜髁突表面的次級軟骨，由軟骨細胞和細胞外基質組成[1]。MCC作為下頜骨的發育中心，對下頜骨的形態發生和長度、高度的增長至關重要[2]。研究表明，多種生長因子和信號通路參與髁突發育，包括成纖維細胞生長因子23，Wnt信號通路及FAM20(family with sequence similarity 20)家族成員蛋白等[3-5]。

FAM20C是FAM20家族三個成員之一，又被稱為牙本質基質蛋白4，是一種高爾基酪蛋白激酶，在多種生理和病理過程中發揮重要作用[6]。FAM20C通過磷酸化S-x-E/pS序列中的絲氨酸殘基，修飾細胞外基質蛋白，參與組織礦化、脂質穩態、傷口愈合、細胞分化等多種生物過程[7]。敲除Fam20C基因的小鼠發生嚴重的低磷性佝僂病，表現為血清和骨中磷酸鹽降低和成纖維細胞生長因子23升高[8]。人類Fam20C突變導致Raine綜合征，表現為骨硬化性骨發育不良、佝僂病、軟骨病以及低磷血癥等[9]。

目前FAM20C在骨、牙齒發育及礦化方面的研究已有一些進展[10-11]，而關于FAM20C在下頜髁突中的表達和作用機制尚無報道。本研究通過免疫組化觀察小鼠出生前后下頜髁突軟骨中FAM20C的表達情況，推測其在下頜髁突發育中的潛在作用，為進一步的機制研究奠定組織學基礎。

1 材料與方法

1.1 動物和組織準備

選取20只8周齡野生型C57BL/6小鼠(體質量18～24 g)作為親代小鼠。實驗設計經哈爾濱醫科大學動物倫理委員會批準。小鼠合籠交配，晨起觀察到陰道栓確定妊娠，記為胚胎0.5 d(E0.5)。取胚胎17.5 d(E17.5)和出生后0、7、21 d(P0、P7、P21)共4個時間點小鼠的下頜髁突，4%多聚甲醛常規外固定。其中P7和P21組小鼠下頜髁突分別在15%EDTA(pH=7.4)溶液中4 ℃低溫脫鈣3 d和9 d。各組標本以矢狀位常規制作蠟塊，每組選取5個小鼠髁突組織蠟塊進行4 μm厚連續切片，4 ℃保存備用。

1.2 主要試劑和儀器

蘇木素染液、伊紅染液(北京蘭杰柯)；改良番紅O-固綠染色液試劑盒(北京索萊寶)；PV-兩步法免疫組化試劑盒、DAB顯色試劑盒(武漢博士德)；兔抗FAM20C多克隆抗體(哈爾濱醫科大學附屬第一醫院龍江學者實驗室)；HRP標記的羊抗兔二抗(武漢博士德)。Leica DM2500光學顯微鏡(德國徠卡)，Nikon ECLIPSE 80i顯微鏡、NIS-ELements BR 3.0成像分析系統(日本尼康)。

1.3 組織切片染色

1.3.1 蘇木精-伊紅(HE)染色 按照常規染色步驟進行。

1.3.2 改良番紅O-固綠染色 嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.3.3 免疫組化染色 每組選取5只小鼠髁突組織蠟塊，取連續切片中間部位一張進行FAM20C免疫組化染色。檸檬酸修復液(pH=6.0)高溫抗原修復；3%過氧化氫封閉內源性過氧化物酶；山羊血清封閉；一抗(FAM20C，1∶100稀釋)，IgG代替一抗作為陰性對照，4 ℃孵育過夜；二抗37 ℃孵育30 min；DAB顯色；甲基綠復染。

1.3.4 結果判讀 改良番紅O-固綠染色結果判讀：軟骨基質為深紅色，軟骨細胞核為藍色，細胞質、肌肉、膠原纖維及骨組織為灰綠色；免疫組化染色結果判讀：棕黃色顆粒為蛋白陽性表達。

1.4 免疫組化結果的半定量分析

每組選取5只小鼠免疫組化切片進行半定量分析，將每張切片中的髁突分為前、中、后3個部位，在高倍鏡下每個部位隨機選取1個視野拍照。通過Image-pro plus 6.0圖像軟件測量每張切片3個部位FAM20C陽性區域的累計光密度值(integrated optical density，IOD)，以陽性區域IOD與圖片面積的比值——平均光密度值(mean optical density，MOD)作為免疫組化半定量指標，每張切片3個部位MOD取平均值，即為該切片FAM20C的陽性表達強度。

1.5 統計學方法

2 結 果

2.1 組織學結果

鑒于E17.5、P0和P7髁突在100倍鏡下基本可以展示全貌，所以選取100倍鏡下拍照，但是P21髁突體積較大，只選取中間部位拍照。E17.5小鼠髁突染色結果可見髁突軟骨明顯，番紅O染色可見基質充滿細胞間隙，軟骨細胞排列整齊。P0小鼠髁突染色結果可見髁突軟骨的長度和寬度明顯增加，尤其是肥大細胞區，各層軟骨細胞清晰可辨，包括關節表面纖維層、靜止軟骨細胞層、增殖軟骨細胞層、前肥大軟骨細胞層、肥大軟骨細胞層(非礦化)和礦化肥大軟骨細胞層。P7小鼠髁突染色結果可見髁突前、中、后帶輪廓初具，髁突軟骨初級結構基本形成。P21小鼠髁突染色結果可見髁突前、中、后帶形態分明，發育接近完成。P0、P7、P21，隨著軟骨內骨化的進展，肥大軟骨細胞層縱向縮短，軟骨下骨體積增加，下頜髁突體積增大。見圖1～3。

Td：顳下頜關節盤；S：關節表面纖維層；R：靜止軟骨細胞層；P：增殖軟骨細胞層；Pr：前肥大軟骨細胞層；H：肥大軟骨細胞層(非礦化肥大軟骨細胞區)；M：礦化肥大軟骨細胞層；Sub：軟骨下骨

2.2 免疫組化染色結果

4組小鼠髁突軟骨組織中均有FAM20C表達，隨著髁突軟骨發育，FAM20C表達逐漸減少。在增殖軟骨細胞層中，FAM20C主要位于細胞核；在前肥大軟骨細胞層和肥大軟骨細胞層中，FAM20C主要位于細胞質。E17.5組，在增殖軟骨細胞層、整個肥大軟骨細胞層及軟骨下骨中均可以看到FAM20C強陽性染色且分布廣泛。P0組，在增殖軟骨細胞層和前肥大軟骨細胞層中FAM20C陽性染色較明顯，肥大軟骨細胞層中染色相對較弱且散在分布。P7組，FAM20C陽性染色主要集中在增殖軟骨細胞層和軟骨下骨中，肥大軟骨細胞層中陽性染色零星分布。P21組，陽性染色明顯減少，主要沿增殖軟骨細胞層分布，肥大軟骨細胞層及軟骨下骨中極少量表達。見圖4。

A：E17.5；B：P0；C：P7；D：P21

A：E17.5；B：P0；C：P7；D：P21

A：E17.5；B：P0；C：P7；D：P21

2.3 FAM20C表達的半定量分析

E17.5、P0、P7和P21組中FAM20C的MOD值分別為0.583±0.015、0.479±0.023、0.353±0.014和0.281±0.013，組間比較F=306.296，P<0.05，4組MOD差異具有統計學意義(P<0.05)，兩兩組間比較差異均具有統計學意義(P<0.05)。

3 討 論

FAM20家族由 FAM20A、FAM20B和FAM20C三個成員組成[12]。條件性敲除小鼠Fam20B，小鼠髁突軟骨細胞增殖能力減弱，軟骨分化過程受到抑制，髁突形態纖薄短小，證明Fam20B對于髁突軟骨發育至關重要[5]。研究表明FAM20C可以磷酸化修飾大多數分泌蛋白。其中小整合素結合配體-N-連接糖蛋白家族(small integrin binding ligand-N-linked glycoproteins，SIBLINGs)在髁突軟骨發育過程中發揮重要作用，而該家族成員蛋白已被證明是FAM20C的直接底物[6,13]。此外，在長骨成骨過程中，長骨軟骨細胞和成骨細胞中可以檢測到FAM20C mRNA，在成熟軟骨細胞、關節軟骨細胞和增生性軟骨細胞中可以檢測到FAM20C蛋白，表明FAM20C可能參與長骨軟骨的形成[14]?；谏鲜鲅芯拷Y果，我們猜測FAM20C可能參與髁突軟骨發育。

本實驗在使用傳統HE染色進行組織學觀察的基礎上，結合改良番紅O-固綠染色方法觀察了下頜髁突軟骨及軟骨下骨的形態學變化。因為軟骨基質含有特定的蛋白多糖，這些蛋白多糖包含許多陰離子糖鏈，可以結合番紅O、固綠進行染色。軟骨與番紅O結合呈現紅色，骨與固綠結合呈現綠色或藍色，與呈現紅色的軟骨對比鮮明，從而將軟骨組織和骨組織區域明顯分開[15]。本實驗改良番紅O-固綠染色結果表明：隨著軟骨內骨化的進展，軟骨細胞層縱向縮短，軟骨下骨體積增加，這與既往研究結論一致[5]。

在哺乳動物中，骨形成的方式有兩種：膜內成骨和軟骨內成骨。傳統觀點認為MCC的成骨方式為軟骨內成骨，即軟骨祖細胞首先通過增殖和分化成軟骨細胞形成軟骨，后軟骨細胞肥大、凋亡，引發血管侵入，最終被骨取代[16]。近期有研究表明，少量軟骨細胞可以在下頜髁突組織中直接分化為成骨細胞，參與下頜髁突軟骨下骨的形成[17]。在軟骨內成骨過程中，軟骨細胞經歷嚴格控制的增殖和分化階段，調節軟骨內骨的縱向生長[18]。本實驗研究結果顯示：在4個時間點，增殖軟骨細胞層中均有FAM20C陽性表達，且隨著時間的推移，陽性表達逐漸減少。在胚胎期及出生后早期階段的肥大軟骨細胞中FAM20C高表達，而在髁突軟骨發育后期FAM20C表達較弱，這表明FAM20C可能參與了髁突軟骨早期軟骨細胞的分化。

本實驗結果提示FAM20C在小鼠下頜髁突發育中具有一定的生物學作用，可能通過調節軟骨細胞增殖和軟骨細胞分化速率來塑造或維持下頜髁突軟骨的形態，參與下頜髁突成骨過程，關于FAM20C調控下頜髁突發育的具體機制尚需進一步體內外研究。