HPLC測定豆制品中丙酸鈣結果的不確定度評價*

劉強欣，林 婷，聞佳鈺，王志超，鐘寒輝，董葉箐

(綠城農科檢測技術有限公司，浙江 杭州 310522)

豆制品營養豐富，豆能夠降低人體血液中的膽固醇，有預防消化系統癌癥及其他疾病的功效。因此被廣大消費者譽為21世紀最喜愛的食品之一[1]。然而豆制品保存卻相對較難容易變質腐敗，為了延長豆制品的保質期，人們會添加一些食品防腐劑。丙酸(propanoic acid)及其鹽類是世界衛生組織(WHO)和聯合國糧農組織(FAO) 批準使用的安全可靠的食品防霉劑[2]，具有抑制微生物增殖和殺滅微生物的作用，是天然防腐劑的重要組成部分，能參加人體正常新陳代謝，對于人體無害[3]，常以丙酸鈣或丙酸鈉的形式存在，用于食品防腐和防霉[4]。有關研究表明人體長期過量攝入含丙酸及其鹽類的食品會導致嘔吐、腹痛和肺水腫等[5-6]，食品安全國家標準GB 2760-2014《食品安全國家標準 食品添加劑使用標準》[7]規定豆類制品限量為2.5 g/kg(以丙酸計)。

測量不確定度是對測量結果質量的定量表征，很大程度上決定了測量結果的可靠性[8-10]，為了保證豆制品中丙酸鈣含量檢測結果科學性，依據測定不確定度準則[11-13]參照標準GB 5009.120-2016 《食品安全國家標準 食品中丙酸鈉、丙酸鈣的測定》[14]，建立數學模型，對結果進行不確定度評估，為結果的可靠性、準確性提供了科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實驗采用的試劑為：甲醇(色譜純)，Fisher；磷酸氫二胺(分析純)，浙江長青化工；磷酸(分析純)，浙江長青化工；丙酸鈣(純度98.0%)，Dr.Ehrenstorfer；其余試劑均為市售分析或以上規格，浙江長青化工；超純水儀制備；混合微孔濾膜(0.22 μm)；豆制品，超市購買。

1.2 儀器與設備

實驗采用的儀器為：島津LC-2030C高效液相色譜儀器(配有二極管陣列檢測器)，日本島津公司；BSA224S型電子天平，德國賽多利斯；Kjeltec 8400凱式定氮儀，foss；pHS-3C酸度計，雷磁；色譜柱(Agela Innoval ODS-2 ；250 mm× 4.6 mm，5.0 μm)；超純水系統，美國Millipore超純水儀制備。

1.3 液相色譜參考條件

(1)色譜柱：Agela Innoval ODS-2(250 mm×4.6 mm， 5.0 μm)；

(2)流動相：甲醇+1.54 g/L磷酸氫二胺=5+95；

(3)檢測波長：214 nm；

(4)柱溫：40 ℃；

(5)流速：1.0 mL/min；

(60進樣體積：20 μL。

1.4 試樣處理

準確稱取25 g置于250 mL燒杯中，轉移置于500 mL蒸餾瓶中加入100 mL水，再用50 mL水沖分多次沖洗燒杯，洗滌液合并至蒸餾瓶中，加入20 mL磷酸溶液(1 mol/L)，通過水蒸氣蒸餾，將250 mL容量瓶作為吸收液裝置，待蒸餾至約 240 mL時取出，在室溫下放置30 min，用1 mol/L磷酸溶液調pH為3左右，加水定容至刻度，搖勻，經0.45 μm 微孔濾膜過濾后，進液相色譜測定。

2 模型建立

根據樣品測試方法的過程，建立豆制品中丙酸鈣(以丙酸計)殘留量不確定度評估數學模型為：

注：X為試樣中丙酸含量，g/kg；ρ為由標準曲線得出的試樣液中待測物的質量濃度，mg/L；V為樣液最終定容的體積，mL；m為試樣的稱樣量，g；1000為由mg/kg轉換為g/kg的換算因子。

3 結果與分析

3.1 不確定度的引入：標準溶液

標準儲備液的配制過程：精確稱取0.234201 g丙酸鈣標準物質(純度為98.0%)，加水溶解并定容至25 mL，折算為丙酸后標樣濃度為7304.2 mg/L。

標準工作液的配制過程：分別吸取丙酸標準儲備液0.171 mL、0.342 mL、0.856 mL、1.711 mL、3.423 mL 于500 mL蒸餾瓶，按照試樣處理進行蒸餾，最終用水定容置250 mL容量瓶，配制成濃度為0.005 g/L、0.01 g/L、0.025 g/L、0.05 g/L、 0.1 g/L的標準工作溶液。

3.1.1 不確定度u(p)的引入：標準物質純度

丙酸鈣標準物質證書上的相對不確定度urel(p)=2.0%

3.1.2 不確定度u(m)的引入：標準物質稱量

丙酸鈣標準物質的稱取量為0.234201 g，通過配恒體方法兩次的測量值相減得出，則由稱量產生的相對標準不確定度應為：

3.1.3 不確定度u(V)的引入：標準物質配制

(1)不確定度的引入：配制標準儲備液所有容器

將稱取的丙酸標準物質溶解并定容至25 mL的容量瓶中，根據JJG 196-2006[15]《中華人民共和國國家計量檢定規程》，在(25±1)℃時25 mL單標線容量瓶(A級)容量允許為 ±0.03 mL，其不確定度為矩形分布(B類評定)，則容量瓶的不確定度為：

(2)不確定度的引入：配制標準工作液所有容器

①引入的不確定度來源：移液管

移液管準確移取標準儲備液置于500 mL 蒸餾瓶中，經蒸餾配制成相應濃度的工作液，根據JJG 196-2006[15]， 移液管(A級)對于的允許誤差如表1所示。

表1 工作液濃度、移取體積及對于移液管最大允許誤差

則移液管的不確定度為：

②不確定度的引入：容量瓶

丙酸標準工作液最終定容至250 mL 容量瓶，依據JJG 196-2006[15]，(25±1)℃時250 mL 單標線容量瓶(A級)允許容量為±0.15 mL，則不確定度為矩形分布(B類評定)，容量瓶的不確定度是：

因此容器引入的相對不確定度為：

=1.54%

3.1.4 不確定度u(g)的引入：標準曲線擬合

上機測定丙酸標準曲線上5個不同工作液濃度，對應的峰面積與濃度如表2所示。

表2 標準工作液濃度與對應峰面積

采用最小二乘法，以丙酸的濃度X與其對應的平均峰面積Y進行線性擬合，得丙酸的標曲線：Y=339743X-35.992，線性相關系數為0.999。

對測試樣進行6次測量，得峰面積A，由標準曲線方程求得提取液中丙酸的濃度分別為0.258 g/kg、0.252 g/kg、0.249 g/kg、0.255 g/kg、0.249 g/kg、0.261 g/kg，平均值為0.254 g/kg，最小二乘法擬合標準工作曲線求得樣品中丙酸含量過程所引入的相對不確定度為：

其中：

則最小二乘法擬合過程產生的相對標準不確定度為：

3.2 液相色譜儀測定引入的不確定度

3.3 樣品引入的不確定度

3.3.1 樣品稱量引入的不確定度u(M)

3.3.2 樣品定容引入的不確定度u(a)

試樣最終定容至250 mL 的容量瓶，依據JJG 196-2006[15]，(25±1) ℃時250 mL 單標線容量瓶(A級)允許容量為 ±0.15 mL，則不確定度為矩形分布(B類評定)，容量瓶的不確定度是：

3.4 不確定度的引入：樣品測量重復性

對待測樣品進行六次重復性測定，所得結果見表3所示。

表3 樣品六次平行所測結果

得出測量重復性引入的相對不確定為：

3.5 標準不確定度分量

不確定度分量不確定度來源不確定度值/%u rel(M)樣品稱量0.00116u rel(a)樣品體積0.0346u rel (p)標準物質純度2.00u rel(m)標準物質稱量0.174u rel(v)標準溶液配制1.54%u rel(g)標準擬合曲線0.250u rel(e)樣品重復測量1.93u rel(y)儀器系統0.924

3.6 合成標準不確定度的計算

=3.32%

3.7 擴展不確定度

在95%的置信區間下，取包含因子k=2，其相對擴展不確定度為：

Urel(X)=k×urel(X)=2×3.32%=6.64%

豆類制品中丙酸鈣(以丙酸計)的含量為0.254 g/kg，得擴展不確定度為

U=0.254 g/kg×6.64%=0.0169 g/kg

綜上可得豆類制品中丙酸鈣(以丙酸計)含量的不確定度報告為：(0.254±0.0169)g/kg(k=2)。

4 結 論

通過對豆制品中丙酸鈣含量的不確定度評定，得出樣品中丙酸鈣(以丙酸計)的含量為 (0.254±0.0169) g /kg，k=2，置信概率 P=95%。本文全面地分析了HPLC法測定丙酸含量實驗過程不確定度的來源，并計算了各不確定度分量。結果表明，標準物質純度和樣品重復性測定是合成不確定度的主要來源。因此日常檢測中所使用的儀器、配制溶液的步驟，環境、試劑等客觀影響因子都必須達到標準要求，不斷提高操作人員的熟練程度以提升檢測結果的準確性。