南四湖水體一種好氧反硝化細菌的分離與鑒定

王 磊 孫雪晴 周 晶

（1 東營市水務事業發展中心，山東東營 257091；2 曲阜師范大學，山東曲阜 273165）

南四湖是山東省內最大的淡水湖， 同時也是南水北調東線山東段主要調蓄水庫， 是山東省重要的水源地。沿湖地區污染排放及湖內的水產養殖、航運等活動嚴重影響水質， 關乎沿湖居民的飲用水安全和南水北調東線的用水安全[1]。 近年來，南四湖的水體污染備受關注， 水體富營養化程度日趨嚴重。2010—2011 年枯水期期間， 南四湖湖區水位下降，水體溶解氧水平提高，總氮含量有所下降，說明該湖區的好氧反硝化細菌有較高效的反硝化作用[2]。 因此，對南四湖中的好氧反硝化細菌進行分離純化、篩選及鑒定， 即可得到具有高效反硝化作用的好氧反硝化細菌菌株， 并且通過對南四湖中好氧反硝化細菌的分離篩選及研究， 能較準確地了解南四湖水體富營養化程度， 為今后降低其水體富營養化提供生物學方向的啟示。

19 世紀80 年代人類首次分離出反硝化細菌，隨后陸續發現了多種兼性厭氧的反硝化細菌[3]，例如丙酸桿菌屬、克雷伯氏菌、螺旋菌屬等。 隨著科學技術的進步及發展，又發現了多種好氧反硝化細菌（逾50 個屬130 個種），例如假單胞菌屬[4]、施氏假單胞菌[5]、產黃桿菌[6]、無色桿菌屬[7]、嗜堿副球菌[8]、副球菌屬[9]等。目前，好氧反硝化細菌成為研究熱點，人們重點關注好氧反硝化細菌的脫氮能力及在實際中的應用。反硝化細菌可以把電子傳遞給氧氣，同時也能在硝酸還原酶的作用下傳遞給硝酸根[10]。 學者們也越來越多地將反硝化細菌與污水處理相結合， 并已經取得重大成果。反硝化細菌與水生態、水環境相結合的研究方向逐漸被關注， 并成為近年來人們的研究重點。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1富集培養基。 NaNO30.85 g/L， 琥珀酸鈉2.84 g/L，KH2PO41.36 g/L，MgSO4·7H2O 0.19 g/L，（NH4）2SO40.27 g/L， 酵母提取物1 g/L。 微量元素：FeSO4·7H2O 0.2 g/L，CoCl2·7H2O 1 g/L，Na2MoO4·7H2O 0.38 g/L，CaCl20.2 g/L，pH 值7.2[8]。

1.1.2分 離 培 養 基。 KNO31 g/L，KH2PO41 g/L，FeCl2·6H2O 0.5 g/L，CaCl2·7H2O 0.2 g/L，MgSO4·7H2O 1 g/L，琥珀酸鈉8.5 g/L，溴百里香酚藍1%，乙醇溶液1‰，瓊脂15 g/L，pH 值7.0~7.3[9-10]。

1.1.3反硝化培養基。 KNO30.6 g/L，KH2PO41 g/L，K2HPO41 g/L，MgSO4·7H2O 0.2 g/L， 檸檬酸鈉5 g/L，pH 值7.0[11]。

1.1.4LB 培養基。胰蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，NaCl 10 g/L，pH 值7.2。

1.2 試驗方法

1.2.1南四湖養殖水體的取樣。 選取南四湖河蟹圍網養殖區作為采樣區[12-13]，采用五點采樣法在河蟹圍網養殖區采樣。取樣后立即帶回實驗室，并將其放入4 ℃冰箱中保存備用。將分離菌株接種在反硝化液體培養基上進行復篩， 即吸取培養液將其滴在干凈的白瓷板上，加入Griess 溶液Ⅰ、溶液Ⅱ，觀察結果。若結果呈現紅色， 則可證明含有亞硝態氮； 若顯示無色， 且在加入二苯胺-硫酸試劑后生成了藍色的沉淀，則可以證明含有硝態氮；若加入二苯胺-硫酸試劑后溶液依舊顯示無色， 則證明無亞硝態氮和硝態氮的存在。

1.2.2反硝化菌株的鑒定。 生理生化鑒定參照常見細菌系統鑒定手冊[5]。 用于16S rRNA 反應的引物為通用引物，正向引物為27F（5′-AGAGTTTGATCCTG GCTCAG-3′），反向引物為1492R（5′-GGTTACCTTGT TACGACTT-3′）[14]。PCR 反應程序：94 ℃預變性4 min；95 ℃變性35 s；56 ℃復性30 s；72 ℃延伸90 s，35 個循環；72 ℃延伸10 min。PCR 產物由青島派森諾生物科技有限公司進行測序。 測序結果，在NCBI 數據庫中采用序列比對并構建出系統發育進化樹。

2 結果與分析

2.1 形態特征

由圖1 可知， 經篩選后的菌株S-5 在培養皿上的菌落呈現為微黃色，菌落表面濕潤粗糙不透明，經革蘭氏染色后顯示為陽性。其細胞形態顯示為桿狀，有周生鞭毛。

2.2 分子生物學特征

經過PCR 擴增以及瓊脂糖凝膠電泳后，得到菌株16S rDNA 序列的電泳圖如圖2 所示，其中，圖片所顯示的第5 列為目標菌株S-5 的結果， 除第1 列為Marker 外，其他均為對照。 在本試驗中，所需目的片段大小約為1 500 bp。 之后經過測序可以得知，該片段的大小為1 422 bp。

將測序結果在NCBI 進行BLAST 比對后得知，目標菌株的序列跟蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）的序列相似性極高，為99.93%，且與芽孢桿菌屬中的3 株序列相似度達到了100%，這3 株序列的基因序號分別為MG787231.1、MK445142.1 以及KY312798.1。挑選序列相似度較高的菌株運用MEGA 6.1 軟件，采用鄰接法（neighbour-joining）制作系統發育進化樹，其結果如圖3 所示。 結合形態學分析及系統進化樹的結果分析， 基本可以判定篩選出的菌株屬于芽孢桿菌屬，為蠟樣芽孢桿菌。

3 結論與討論

3.1 結論

從南四湖養殖水體采樣， 采用富集培養得到反硝化細菌， 通過形態學觀察、16S rRNA 基因序列分析及同源性比對，初步鑒定該菌株屬于芽孢桿菌屬，為蠟樣芽孢桿菌。

3.2 討論

近年來， 南四湖水體富營養化雖然處于較高水平，但較前幾年有了極大程度的降低，南四湖水產養殖戶也有投放益生菌的行為。因此，南四湖水體中可能含有大量的反硝化細菌， 通過對養殖水體中反硝化細菌的研究， 可得到后期解決南四湖富營養化的生物學方法。

本研究發現南四湖養殖水體中的反硝化細菌為蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus），屬于芽孢桿菌屬。經調查，南四湖區域應用的水產益生菌均為枯草芽孢桿菌，而蠟樣芽孢桿菌致病性較強，可以從人工益生菌菌種中排除。反硝化細菌多在厭氧條件下生存，而芽孢桿菌屬多在有氧或兼性厭氧的條件下生存， 該菌株的發現為南四湖富營養化水平的降低提供了一種好氧反硝化細菌的操作方式， 也為今后南四湖地區好氧反硝化細菌菌種篩選提供了一系列經驗。Gatesoupe[15]研究表明，蠟樣芽孢桿菌進入宿主體內能夠迅速定殖，并可通過分泌蛋白酶和淀粉酶等大分子物質提高宿主的消化機能，促進營養物質的消化吸收。 孫 娜等[16]研究發現，蠟樣芽孢桿菌具有產淀粉酶的特性， 試驗組大菱鲆幼魚腸道內消化酶活力的提高可能與該菌定殖于幼魚腸道后分泌的胞外酶有關，其中淀粉酶、蛋白酶等胞外酶能夠協助機體消化營養物質，促進飼料中營養素的降解，提高飼料利用率。 崔廣鑫等[17]研究也表明，蠟樣芽孢桿菌對大菱鲆幼魚體內的抗氧化能力產生了積極影響。綜上所述，蠟樣芽孢桿菌有利于促進高等水生生物生長、 維持水體浮游生物生態平衡。

本研究確認了南四湖養殖水體中存在芽孢桿菌屬，芽孢桿菌屬是解磷菌的重要菌種，國內研究解磷菌已有100 多年歷史。 Zeeuw[18]發現，某些難溶性的復合物施入土壤可作為磷源。 1948 年，Gerretsen[19]發現植物施不溶性磷肥，接種土壤微生物后，有利于磷吸收，從而促進植株生長。 有學者從土壤中分離出一種解磷巨大芽孢桿菌（B. megateriumvar.phosphaticum），其能分解核酸、卵磷脂，可提高土壤有效磷含量[20]。 尹瑞齡[21]從土壤中分離出265 株細菌，并測定了其溶解摩納哥磷礦粉的能力，發現培養6 d 后，溶磷能力平均為2~30 mg/g，其中巨大芽孢桿菌、節桿菌、黃桿菌、歐文氏菌及假單胞桿菌解磷能力很強，達到25~30 mg/g。 Paul 等[22]發現，從豆科植物根際分離的幾株芽孢桿菌溶解磷酸三鈣效率較高，達18%。 陸洪省等[23]從黃河三角洲鹽土中分離純化了1 株具有高效解磷能力的菌株， 屬于芽孢桿菌屬， 與Bacillus thuringiensis同源性達98%。李 輝等[24]從蚯蚓糞分離篩選到7 株有解磷效果的菌株，短小芽孢桿菌（Bacillus pumilus）解磷能力最強。 魏烈群等[25]從榮成天鵝湖沉積物中篩選出10 株有機解磷菌，溶磷圈直徑比為1.05~4.11，均屬于芽孢桿菌屬（Bacillus）。 羅利均[26]通過紫外線—氯化鋰誘導水體中采集的蠟狀芽孢桿菌，變異篩選后活性磷濃度提高了29.3%， 磷酸鈣發酵液中活性磷濃度提高了28.0%， 焦磷酸鈣發酵液中活性磷提高了26.5%，同時變異菌產有機酸能力與植酸酶活性增強。

近10 年來，國內外研究表明，蠟樣芽孢桿菌對重金屬鉻、鎘、鉛的耐受能力極強，變異菌株對重金屬離子還原、吸附具有較強的能力。黃飛[27]研究表明，在重金屬復合污染水體，Cu、Zn、Cd 和Pb 最高超標倍數分別達6 倍、20 倍、35 倍和3 倍，Cd 離子濃度高達150 mg/L 時蠟狀芽孢桿菌（Bacillus cereus）仍然可以生長。陳志[28]從鉻渣中分離的蠟狀芽孢桿菌具有耐受和還原Cr6+態離子團能力， 其細胞碎片和胞外分泌物都具有還原活性。另外，還證實了蠟狀芽孢桿菌胞外分泌物能夠與細菌競爭配位Cr3+離子。 李 輝等[29]從沈陽受鎘污染土壤中篩選出高耐鎘性蠟狀芽孢桿菌（Bacillus cereus），能夠有效吸附Cd2+，且靜電吸附、離子交換作用、表面配合作用是主要吸附機制。

本研究中， 經過一系列篩選分離操作得到的菌株在序列比對后， 發現與其他在含重金屬錳的環境下分離出的菌株序列相似性極高， 表明該菌有很好的反硝化潛力， 這為蠟樣芽孢桿菌的應用提供了新思路和新方向。因此，推測該菌株也有可能具有高抗錳的特性，與文獻提到的蠟狀芽孢桿菌高抗鎘、鉻特性相符， 為今后降低重金屬地區富營養程度提供了研究思路， 并且為南四湖地區環境污染的防治提供了生物學方法。 南四湖水體及沉積物的芽孢桿菌屬的反硝化能力、解磷能力以及芽孢桿菌生長對水體可溶性磷含量變化、C/P 值變化、藻類生長的影響都未見報道，有待進一步研究。