海欖雌根多糖提取及其抗氧化活性研究

陳吳海 曹雯婷 李興隆 葉劍芝 李 培 趙來金

（1 中國熱帶農業(yè)科學院農產品加工研究所，廣東湛江 524001；2 云南農業(yè)大學熱帶作物學院，云南普洱 665099）

海欖雌（Avicennia marina（Forsk.） Vierh.），又名白骨壤、海豆，為馬鞭草科灌木植物，在我國常分布于臺灣、福建和廣東。主要生長于海邊和海岸鹽沼潮濕濕潤地帶，通常為組成海岸植物紅樹林的種類之一。海欖雌紅樹林野生植物群落擁有巨大的經濟、社會和生態(tài)價值，在防護海岸堤壩、防風防浪、促淤固岸、調控海岸生態(tài)平衡等方面發(fā)揮著重要作用[1]。 海欖雌是耐淹水和耐鹽能力很強的紅樹植物，其葉和果實經過鹽水浸泡或用鹽水處理去澀后不僅可爆炒食用或水煮食用，也可用作一些動物的飼料。據相關研究，海欖雌富含可產生抗生素、防腐劑和酶等活性物質的內生菌且部分菌株具有廣譜抑菌活性，可作為開發(fā)新型生物活性化合物的重要來源[2]。

海欖雌作為藥用植物資源，可用于治療瘧疾、風濕、哮喘、天花和潰瘍等多種疾病，具有改善癌癥、腹瀉、炎癥、糖尿病及氧化應激等疾病的藥物特性；此外，還具有抑制植物病原菌[3]、殺蟲[4]及抗衰老[5-6]等功效。然而，目前鮮見紅樹林海欖雌多糖提取及其抗氧化活性研究的報道，其抗氧化活性方面的用途也未得到充分發(fā)掘。

自由基是動物體代謝的正常產物，動物處于正常生理狀態(tài)時，自由基通常保持穩(wěn)態(tài)。當動物體內自由基的動態(tài)平衡遭到破壞時，過量的自由基會對動物機體造成損傷，危害動物健康，甚至引起疾病[7]。研究表明，負離子病毒抗體能夠有效消減自由基，減緩人體衰老，增強人體免疫力。 因此，研究海欖雌多糖提取工藝及其抗氧化活性，對促進紅樹林微生物資源的開發(fā)和應用具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試紅樹林海欖雌采于廣東省湛江市。

試驗試劑：分析純濃硫酸，分析純葡萄糖，苯酚，無水乙醇，丙酮，超純水，1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH），VC，羥基自由基試劑盒。

試驗儀器：紫外可見分光光度計（UV752N），由上海佑科儀器儀表有限公司生產；電熱恒溫水浴鍋（HH.S11-Nis），由北京長安科學儀器廠生產；高速冷凍離心機（CG22G111），由日本日立公司生產；電熱恒溫干燥箱（Fd115），由德國BINDER 生產；電子天平，由賽多利斯科學儀器（北京）有限公司生產。

1.2 試驗方法

1.2.1樣品粉碎。海欖雌根采后自然曬干，然后放入50 ℃恒溫烘箱中烘干后取出，粉碎至20~40 目，在干燥環(huán)境中保存，備用。

1.2.2多糖提取。 先用冷水浸泡粉末2 h，然后用10 L 超純水于80 ℃條件下提取2 次，每次2 h：離心（2 000 r/min，10 min），將上清液真空濃縮至100 mL，加入4 倍體積的95%乙醇沉淀[8]；離心（2 000 r/min，10 min）收集絮狀物，并用300 mL 超純水復溶，真空濃縮除去殘余乙醇，殘留液離心（2 000 r/min，10 min）除去不溶物，上清液真空濃縮，冷凍干燥，得粗多糖，稱重，備用。

1.2.3Sevag 法脫蛋白。首先取氯仿和正丁醇按體積比4∶1 混合配制Sevag 試劑，將冷凍干燥后的海欖雌多糖取出，用適量的超純水將其溶解，將多糖溶液與Sevag 試劑按體積比4∶1 均勻混合[9-10]。靜置一段時間后出現(xiàn)3 層溶液，由于水比有機試劑輕，多糖溶于水即多糖溶液會浮在漏斗的最上層，中層溶液為變性蛋白，下層溶液是有機溶劑，去除變性蛋白層和有機溶劑層，重復上述操作5 次，直到無白色絮狀物為止，最后一次把混有Sevag 試劑的多糖溶液放在通風櫥中靜置過夜[11]。 脫蛋白之后的多糖溶液在200~400 nm 處進行紫外全波長掃描，觀察280 nm 處是否有吸收峰，以此來確定蛋白質是否去除干凈。

1.2.4大孔樹脂脫色。 取70 g 大孔樹脂放入500 mL燒杯中，加95%乙醇浸泡充分膨脹10 h，然后置入有1/3 體積超純水的玻璃柱內（40.0 cm×2.7 cm），之后用超純水淋洗至無明顯乙醇氣味，再用反沖的辦法排盡樹脂柱內的氣泡。 取適量脫蛋白后的多糖溶液，上樣，超純水洗脫，收集多糖溶液，苯酚硫酸法跟蹤多糖是否洗脫完全。合并多糖洗脫液，真空旋蒸濃縮備用。

1.2.5透析。 將透析袋剪成約15 cm 的長度后，放入1.0 mmol/L 乙二胺四乙酸二鈉溶液中，煮沸10 min，超純水漂洗干凈，然后用2% NaHCO3溶液煮沸10 min，超純水漂洗，最后在超純水中煮沸10 min。再用超純水漂洗，冷卻后浸入超純水中并在4 ℃冰箱中保存。將多糖溶液裝入透析袋內，用夾子夾緊袋口，用自來水透析48 h，透析結束后，再在超純水中透析過夜，將多糖溶液在旋轉蒸發(fā)儀上真空濃縮，冷凍干燥后備用。

1.2.6洗滌收集。 按順序用丙酮和無水乙醇將多糖洗滌3 遍， 然后置于通風櫥內讓殘余的有機試劑自然揮發(fā)，待有機試劑揮發(fā)完后，收集多糖固體。

1.2.7苯酚—硫酸法測定多糖含量。配制5%苯酚溶液：取苯酚5 g，置于100 mL 容量瓶中，加超純水至刻度，搖勻后，裝入棕色試劑瓶中，置于冰箱中冷藏儲存?zhèn)溆谩?配制標準葡萄糖母液：準確稱取經105 ℃干燥至恒重的葡萄糖標準品10 mg 于25 mL 容量瓶中，加水至刻度，分別吸取0.05、0.10、0.15、0.20、0.25 mL，并以超純水補至1.0 mL，即得葡萄糖標準濃度0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 mg/L。 然后加入5%苯酚1 mL 及濃硫酸5.0 mL，搖勻冷卻。 室溫下放置20 min 后于490 nm 處測光密度，以1.0 mL 水按同樣顯色操作為空白，以橫坐標為葡萄糖標準濃度、縱坐標為吸光度，制作標準曲線[12-14]。

準確稱取1.0 mg 多糖固體，蒸餾水溶解后定容到10.0 mL 容量瓶中，搖勻，作為多糖儲備液。 然后精確量取多糖儲備液1.0 mL，再用上述方法測定吸光度，然后根據葡萄糖標準曲線計算多糖含量。 計算公式如下：

式中，W為多糖含量（%），m1為從標準曲線中查得樣品測定液中含糖量（μg），m2為樣品質量（g）。

1.2.8DPPH 清除試驗。 DPPH（1，1-二苯基-2-三硝基苯肼），是一種很穩(wěn)定的氮中心的自由基，其無水乙醇溶液呈紫色，在517 nm 衍射波段處有最大吸收，吸光度與濃度呈線性關系[15]。向其中加入自由基清除劑時，可以結合或替代DPPH，使自由基數(shù)量減少，吸光度變小，溶液顏色變淺，借此可評價清除自由基的能力，即通過在517 nm 波長處檢測樣品清除DPPH的效果來計算抗氧化能力[16]。

稱取5 mg DPPH，用95%乙醇溶解并定容于100 mL 容量瓶中備用。配制2 mg/mL 根多糖母液：取母液0.05、0.10、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00 mL 于6 個試管中，分別加超純水至1.0 mL。 測定管：0.5 mL 樣品液+3.5 mL DPPH 液。對照管：0.5 mL 樣品液+3.5 mL 95%乙醇。空白組：0.5 mL 超純水+3.5 mL DPPH 液。反應體系共4.0 mL 溶液，取0.5 mL 樣品液，得粗多糖 終 濃 度 分 別 為0.025、0.050、0.100、0.200、0.500、0.750、1.000 μg/mL。 在黑暗處放置30 min，1 cm 光徑，517 nm，95%乙醇調零，測定各管吸光度值。 各管做3 個平行，取其平均值進行計算。 VC為陽性對照，用超純水溶解，與粗多糖樣品同法制備，按下式計算樣品對DPPH 的清除率。

式中，Ai為測定管的吸光度，Aj為對照組的吸光度，A0為空白管的吸光度[17]。

1.2.9清除羥自由基試驗。 H2O2/Fe2+通過Fenton 反應產生羥自由基， 將鄰二氮菲-Fe2+水溶液中Fe2+氧化為Fe3+，導致536 nm 吸光度下降，樣品對536 nm吸光度下降速率的抑制程度能反映樣品清除羥自由基的能力[18]。-OH 是活性氧中最活潑的氧自由基，幾乎能與活細胞中任何分子發(fā)生反應，可介導機體組織脂質過氧化，蛋白質解聚、聚合，核酸斷裂和多糖裂解等生化過程，引發(fā)組織細胞病變，導致各種疾病發(fā)生和加速機體衰老。 減少此類自由基， 可預防衰老、心血管疾病，并具有防癌、抗癌的作用。

本次羥自由基試驗由試劑盒完成。 底物應用液和試劑三均從購置的試劑盒中直接獲得。 將底物應用液和試劑三應用液，先在37 ℃水浴中預溫3 min。試驗操作在37 ℃水浴中進行。對照管：0.2 mL 超純水+0.2 mL 底物應用液+0.4 mL 試劑三應用液。測定管：0.2 mL 底物應用液+0.2 mL 樣品液+0.4 mL 試劑三應用液。混勻，37 ℃水浴反應1 min，從加完試劑三應用液開始到1 min 結束，立即加入griess 顯色劑2 mL 終止反應，1 次只能做1 個試管。混勻，室溫放置20 min，1 cm 光徑，550 nm，超純水調零，測定各管吸光度值。清除率計算公式如下：

式中，A0為對照管吸光度，Ai為測定管吸光度。

粗多糖用超純水溶解，制備3.2 mg/mL 的粗多糖母液。 取母液配制成5 個濃度梯度（0.80、0.40、0.20、0.10、0.05 mg/mL）。反應體系共0.8 mL 溶液，取0.2 mL樣品液，即體系中粗多糖濃度依次為0.20、0.10、0.05、0.02、0.01 mg/mL。 各管做3 個平行，取其平均值進行計算。 VC為陽性對照，用超純水溶解，與粗多糖樣品同法操作。

2 結果與分析

2.1 線性方程和多糖含量

用標準系列工作溶液繪制標準曲線，根據各吸光度值（y）對質量濃度（x）繪制標準曲線，得到線性回歸方程。 由圖1 可知，在0.02~0.10 mg/L 濃度范圍內線性關系良好，相關系數(shù)R2為0.998 2。 根據苯酚硫酸法測定的海欖雌根多糖含量為59.66%。

2.2 DPPH 清除試驗

由表1 可知， 海欖雌根多糖具有清除DPPH 自由基的作用，且隨著濃度的增加，對DPPH 自由基的清除率呈上升趨勢。 海欖雌根多糖對DPPH 自由基的清除能力隨著濃度增加而增加。 這對于海欖雌根多糖藥理活性研究具有參考意義。

表1 不同濃度海欖雌根多糖DPPH 抑制率

2.3 羥自由基清除試驗

由表2 可知，海欖雌根多糖及VC均具有清除羥自由基的能力，且在試驗濃度范圍內清除羥自由基的作用都呈量效關系。隨著試驗樣品濃度的增加，海欖雌根多糖對羥自由基的清除率呈上升趨勢。 當海欖雌根多糖提取物質量濃度為0.2 mg/mL 時，對羥自由基清除率最高，為74.04%。

表2 不同濃度海欖雌根多糖羥自由基清除率

3 結論

研究結果表明，海欖雌根多糖含量為59.66%；海欖雌根多糖能清除DPPH 和羥自由基，隨著試驗樣品濃度的增加，清除率呈上升趨勢。海欖雌根多糖具有一定的抗氧化活性，可為后續(xù)研究提供參考。