應用全外顯子組測序發現1例肺型BHD綜合征家系FLCN基因c.1579_1580insA位點變異

葉小凱 王琳

肺囊腫的發病機制尚未完全明確，吸煙是其主要病因，然而臨床上也發現很多非吸煙的患者，并且在這一些非吸煙的患者中有的具有家族簇集現象，通過對其家系調查，遺傳圖譜繪制，發現其存在孟德爾遺傳現象。全外顯子組測序是指利用序列捕獲技術將全基因組外顯子區域DNA捕捉并富集后，再進行高通量測序的基因組分析方法，外顯子組序列僅占全基因組序列的1%左右，與人類85%致病基因突變相關，近年來其越來越多的被應用于人類遺傳病研究中，應用全外顯子組測序能夠快速發現罕見遺傳疾病的致病基因。本課題納入臨床工作發現1例非吸煙患者反復因肺囊腫出現自發性氣胸的家系，為明確其肺囊腫伴反復氣胸的病因，應用全外顯子組測序探尋其家族性肺囊腫是否存在遺傳致病因素。

1 資料與方法

1.1 一般資料

遴選出2018年8月—2021年8月我科臨床上發現的具有家族聚集現象的肺囊腫家系，共納入1例肺囊腫家系。先證者王**，女性，45歲，保險代理人，因“咳嗽、胸悶、氣喘3 d”為主訴于2017年2月首次就診我院。門診行胸部CT：右側氣胸，雙肺多發肺囊腫，門診擬“自發性氣胸、肺囊腫”收入院。既往身體健康，無慢性疾病史，無吸煙史。家族遺傳史：其母親有雙肺多發肺囊腫，其妹妹有肺囊腫、反復多次自發性氣胸病史，其2個兒子有肺囊腫。先證者2017年2月7日胸部CT：右側氣胸伴肺囊腫（圖1），入院后行腎臟彩超：雙腎無異常，無腫瘤占位情況。入院給予胸腔閉式引流術，患者治療好轉出院。出院后患者仍反復多次自發性氣胸于當地治療。結合先證者具有家族聚集性氣胸、肺囊腫遺傳特點，推斷其家系存在遺傳性疾病。本研究納入先證者家系3代8人（分別為先證者、其父親、其母親、其妹妹、其弟弟、其丈夫、其2個兒子）作為研究對象，本研究經受試者的知情同意及廈門市海滄醫院倫理委員倫理論證通過。

1.2 方法

遴選出臨床上具有家族聚集現象的肺囊腫家系，對先證者家系進行遺傳咨詢，繪制遺傳圖譜。在簽署知情同意書后，采集先證者標本及家系成員全血各2 mL（EDTA抗凝）送廈門基源醫學檢驗實驗室進行全外顯子組測序，提取外周血白細胞全基因組DNA，進行DNA建庫和捕獲，并進行150 bp雙末端測序，對檢出變異進行生物信息分析，并運用Sanger測序對先證者家系成員進行突變位點的驗證。

1.3 生物信息學分析

對檢出的SNP和Indel變異，采用ANNOVAR軟件進行注釋，注釋信息包括染色體起始和終止位置、參考等位基因、替代等位基因，以及包括基因功能、公共數據庫人群頻率（包括千人基因組，ExAC，GnomAD數據庫等）、蛋白功能預測軟件結果（包括SIFT，PROVEAN，MutationTaster，CADD等）、ClinVar數據庫等信息。對變異進行篩選以及基因型-表型關聯分析。最后，參考美國醫學遺傳學與基因組學學會（ACMG）遺傳變異分類標準與指南對候選基因變異進行變異致病性評估與遺傳解讀。

2 結果

2.1 先證者家系分析

納入先證者家系共3代8人，分別為先證者、先證者父親、先證者母親、先證者妹妹、先證者弟弟、先證者丈夫、先證者大兒子、小兒子，其中先證者反復3次發作自發性氣胸伴肺囊腫見圖1，經住院期間系統檢查，先證者無腎囊腫、纖維毛囊瘤，皮膚角化、腎腫瘤、面部丘疹，不伴有慢性疾病情況。先證者母親、妹妹、大、小兒子有肺囊腫，不伴有慢性疾病情況；先證者父親、弟弟、丈夫沒有肺大泡、肺氣腫。其家系圖譜分析符合常染色體顯性遺傳特征（圖2）。

圖1 先證者氣胸伴肺囊腫

圖2 先證者家系遺傳圖譜

2.2 全外顯子組測序結果及生物信息分析

本全外顯子組基因檢測針對人類基因組的外顯子組的全部區域，覆蓋20 000多個基因，涵蓋85%以上的人類遺傳性疾病。檢測范圍包括基因編碼區單核苷酸位點變異（single nucleotide varients）、小片段插入/缺失等突變類型。對先證者進行全外顯子組測序，共獲得了8 814 253 200測序讀長，總的有效讀長3 7401 954，目標的平均測序深度80.47，目標區域的覆蓋率99.4%，先證者共檢出77 994基因變異，包括同義突變、錯義突變、剪接突變、移碼插入、移碼刪除等（見表2）。經全外顯子組測序分析，發現先證者FLCN基因第14號外顯子上存在一處變異c.1579_1580insA:p.R527fs（NM_144997）（變異詳細信息見表3），該變異為雜合移碼突變，第1579至1580號堿基間插入堿基A，導致氨基酸由精氨酸變成谷氨酰胺，隨后的第75個氨基酸變為終止密碼子，形成截短蛋白，該移碼突變發生在3’端，預計不會導致無義介導的mRNA衰變。檢出變異在千人基因組、gnomAD公共人群數據庫中未見收錄，在ExAC、AF公共人群數據庫中亞洲人群頻率為0.000 1，突變導致蛋白丟失小于10%。根據根據美國醫學遺傳學與基因組學學會（american college of medical genetics and genomics，ACMG）指南，對PVS1進行降級至PVS1_Moderate。對變異進行篩選及基因型-表型關聯分析，發現該基因變異，該基因關聯表型為Birt-hogg-dube syndrome（Birt-hogg-dube 綜合征）（OMIM：135150）。

表1 先證者家系臨床特點

表2 先證者外顯子測序結果

表3 先證者突變情況

2.3 Sanger測序

針對先證者檢出的候選變異位點設計上下游引物，并進行聚合酶鏈式反應，采用Sanger法測序驗證。引物設計：FLCN-F，5’-TGCGGAGCCCTAACTCAATC-3’；FLCN-R，5’-CCCATACCCATACCCGACAG-3’。分別對先證者、父母及其他家系成員進行Sanger測序驗證，結果如圖3所示。

圖3 先證者及家系成員基因測序結果

2.4 變異位點致病性評級

結合全外顯子組測序及Sanger測序結果，根據美國醫學遺傳學與基因組學學會（american college of medical genetics and genomics，ACMG）指南判定該變異為致病性的基因變異（致病性證據等級為PVS1_Moderate+PS4+PM2_Supporting+PP1_Strong）。

3 討論

Birt-hogg-dube（BHD）綜合征是一種以面部丘疹，肺囊腫，大皰病，自發性氣胸，腎腫瘤、腎囊腫、結腸腫瘤為臨床表現的罕見的常染色體顯性遺傳病，皮膚角化、纖維毛囊瘤為其特征改變，其由位于第17號染色體的FLCN基因突變引起[1]。典型的BHD綜合征患者常伴有肺囊腫、面部丘疹、腎臟腫瘤等三聯征表現，然而不同人群其臨床表現仍有明顯差異，中國人群大多僅有肺部表現，表現為肺型BHD綜合征即僅有肺部氣囊或伴有自發性氣胸，較少伴有其他系統損害表現，對于這部分人群如果沒有進行全外顯子組或全基因組檢測常常會導致疾病的誤診。

表4 ACMG致病性評級

現已發現FLCN基因突變位點超過200個，這些突變主要包含小片段的插入/缺失、剪接突變和無義突變，其中c.1285dup是白種人和亞洲人群中最常見的突變[2-3]。查閱維普、萬方中文數據庫，截止2021年12月31日暫未發現該基因變異位點（c.1579_1580insA）相關病例報道，本例為國內首例報道；查閱PubMed英文數據庫，已有4個相關家系病例報道檢出FLCN基因c.1579_1580insA變異，均來自中國家庭，已報道癥狀除了氣胸，肺囊腫，還包括有皮膚病變，腎臟病變和肝臟病變，如淋巴結腫大，脂肪粒，皮疹，腎囊腫，肝囊腫[4-7]。不過與國外報道不同的是，文章研究家系中攜帶FLCN基因c.1579_1580insA變異的陽性病例均僅有肺部損害表現，其中包括65歲的先證者母親。BHD綜合征患者的預后相對良好，盡管腎癌是其最嚴重的并發癥，但其在中國人群的發病率并不高，考慮到先證者檢出變異有50%概率遺傳給子代，我們后續將密切觀察隨訪該家系成員其他癥狀表現，特別是針對腎臟腫瘤的隨訪觀察。

FLCN基因突變如何導致BHD綜合征相關病變其發病機制并不清楚，推斷由于FLCN基因突變導致FLCN蛋白功能喪失從而影響上述生命活動功能進而出現相關疾病。FLCN蛋白參與了多種生命活動過程，包括信號轉導、細胞黏附、溶酶體和線粒體的生物合成、纖毛形成、細胞能量代謝和營養穩態等。FLCN基因目前被認為是一種抑癌基因，攜帶FLCN變異基因的患者腎癌的患病率高[8-9]。現有研究表明FLCN基因可能通過參與雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信號通路、TGFβ/BMP 信號通路、Rho A信號調控、PGC1α驅動的線粒體生物合成、TFE3/TFEB轉錄調控等多種細胞信號通路調控從而起到腫瘤抑制作用[10-15]，而FLCN基因發生變異時通過上述信號通路產生的腫瘤抑制作用將大大減弱。FLCN基因突變所引起的肺部氣囊病變，其病理改變是肺泡囊性擴張所形成的肺囊腫，當肺氣囊發生破裂可形成自發性氣胸，該致病機制目前尚不清楚。本研究家系先證者其肺部多發囊性病變伴反復自發性氣胸表現為肺型BHD綜合征，其FLCN基因第14號外顯子上c.1579_1580insA:p.R527fs（NM_144997）移碼插入，導致FLCN蛋白過早截短蛋白及功能喪失，考慮為其致病基礎。FLCN蛋白在肺內巨噬細胞、纖維原細胞以及I型肺泡上皮細胞表達，相關研究表明當其基因發生突變時，通過巨噬細胞和纖維原細胞會分泌大量的炎性因子，誘發炎癥，最終造成肺內彈性纖維的破壞而導致氣胸[16]，其病理表明因為炎癥導致肺結構的改變引起氣囊的形成及氣胸的發生[16]。也有研究表明，FLCN基因突變導致FLCN單倍體不足，進而導致肺成纖維細胞功能障礙，影響肺組織修復能力[17]。處此之外也有研究表明，FLCN在中胚層間葉細胞中的缺失導致肺泡生長顯著減少及破壞，導致氣囊[18]。

外顯子組序列僅占全基因組序列的1%左右，卻包含了大約85%的已知致病基因變異。近年來隨著全外顯子組檢測技術的發展，其越來越廣泛的運用于人類遺傳性疾病的研究。以往傳統篩查遺傳疾病主要通過連鎖分析和關聯分析，以家系為單位，多采用以假說為導向的候選基因法，選定一個或幾個候選基因，在家系成員中對這些候選基因進行Sanger測序，根據基因表型與疾病表型確定候選基因與疾病質檢關系。此方法不僅研究效率低，且需要樣本多，對于罕見疾病或人數稀少的小家系不適用。全基因組測序可直接發現變異位點，但其費用昂貴，且檢測到的變異位點多位于非功能區域。外顯子組測序具有以下優勢：可針對連鎖分析不能檢測的罕見疾病和小家系進行檢測；可以將不同家系樣本綜合研究；僅對編碼蛋白的功能區域進行測序，定位準確；研究周期短，大大加快研究進程，相比以上兩種方法，外顯子組測序是一種經濟、簡潔、快速的尋找致病基因的方法。

文章研究通過應用全外顯子組測序技術，在納入研究的具有遺傳疾病特征的小樣本家系的先證者中發現了FLCN基因c.1579_1580insA位點變異，在其他陽性家系成員中，采用Sanger測序驗證同樣檢出該變異，故該變異在本次研究家系中呈現共分離特點，通過應用生物信息分析及致病性分析進而鎖定該致病基因變異。盡管我們檢出了c.1579_1580insA位點變異，但是該變異如何導致BHD綜合征，其發病機制仍不清楚有待進一步研究。通過本研究，建議臨床上若出現不明原因肺囊腫，并呈現家族聚集性，應進行基因檢測以明確是否存在遺傳因素，全外顯子組測序作為一種經濟、簡潔、快速的檢測技術，應作為輔助臨床診斷的首選技術，文章研究為后期肺囊腫的臨床診療指南的制定提供了借鑒內容。