毛竹林和闊葉林凋落物互置對土壤氮礦化的影響及微生物貢獻

盧小妮,陳露雨,李永春,*,方 韜,胡曉嫣,李永夫,俞葉飛

1 浙江農林大學環境與資源學院/浙江省森林生態系統碳循環與固碳重點實驗室/亞熱帶森林培育國家重點實驗室, 杭州 311300 2 浙江省大盤山國家級自然保護區管理局, 磐安 322300

微生物是連接植物與土壤的紐帶,在土壤生物地球化學循環中起著關鍵作用[11]；添加凋落物的量決定了土壤微生物群落的結構及底物利用模式[12]。高質量的凋落物含有較多相對易降解的化學物質,因此易于被大多數土壤微生物群落降解；而低質量的凋落物往往含有較多不易被微生物快速降解的高抗性或有毒成分,所以具有較強的主場效應[13]。已有研究表明,土壤細菌和真菌群落相對豐度與凋落物初始木質素與氮的比率及碳氮比有關[14]。土壤微生物作為土壤有機質分解和氮礦化的總工程師,細菌和真菌參與了土壤凈氨化和凈硝化過程[15]。使用放線菌酮和鏈霉素選擇性抑制真菌和細菌群落,可以更好地探明真菌和細菌在氮素礦化中的貢獻[16]。添加放線菌酮或鏈霉素可促進氮素礦化[17],而添加放線菌酮會使旱雀麥和三齒蒿土壤中總氮礦化降低[18],表明真菌在土壤總氮礦化中發揮主要作用。采用抗生素解析真菌和細菌群落在氮素礦化中的貢獻已有報道,但結合抗生素抑制和凋落物輸入質量變化探究真菌和細菌對土壤氮素礦化的貢獻尚鮮見報道。

毛竹(Phyllostachysedulis)主要分布在我國亞熱帶地區,由于其快速生長、強大的繁殖和再生能力[19],可以快速擴張到鄰近的天然林[20]。由于氮是植物生長重要的限制性養分,入侵植物如何影響土壤氮素水平及有效性是理解入侵機制的重要環節[21]。毛竹入侵闊葉林使土壤的凈氮礦化增加[22],且毛竹苗在銨態氮為主的氮源時生長更占優勢[23]。此外,毛竹林土壤氮礦化速率與凋落物數量呈正相關,與凋落物碳氮比呈負相關[20]。與凋落物降解存在主場效應一樣,土壤有機質分解的“激發效應”也存在主場效應,表明特定的凋落物降解群落驅動的激發效應[24],可能通過增強誘導“激發效應”從而影響土壤氮礦化。為此,本研究選取次生常綠闊葉林和毛竹入侵后形成的毛竹純林,分別代表未被入侵和受到重度入侵的植被類型,對林地凋落物進行保留、去除和置換處理；并采集處理小區內的土壤樣品,進行室內氮素礦化培養試驗測定土壤凈氮礦化速率,結合添加抗生素解析真菌和細菌群落對土壤氮素礦化的相對貢獻。本研究擬回答以下科學問題：(1)在毛竹入侵次生闊葉林過程中,輸入凋落物化學性質和降解生境的改變如何影響土壤氮礦化速率？(2)前述凋落物化學性質和降解生境改變后,真菌和細菌群落對土壤氮素礦化的相對貢獻是否改變？本研究旨在探明毛竹林和闊葉林地上凋落物對土壤氮素礦化的影響及微生物群落的貢獻,以期為闡明毛竹入侵生境不同類型凋落物輸入調控土壤氮礦化過程提供理論依據。

1 研究區域與研究方法

1.1 研究區域概況

實驗區域位于浙江省杭州市臨安區天目山國家級自然保護區(30°18′30″—30°21′37″N, 119°24′11″—119°27′11″E),天目山保護區是中國亞熱帶生態系統中植物物種最豐富的區域之一。本研究區域氣候為亞熱帶季風氣候,年均氣溫為8.8—14.8℃,年均降水量為1390—1870 mm,平均無霜期為209—235 d。亞熱帶常綠闊葉林為本區域的地帶性植被,區域內闊葉林優勢樹種主要為青岡(Cyclobalanopsisglauca)、木荷(Schimasuperba)和苦櫧(Castanopsissclerophyll)等,自20世紀70年代以來經歷了毛竹入侵[25]。在毛竹入侵典型區域,根據毛竹擴張水平方向和海拔由低到高,依次劃分為入侵后形成的純毛竹林、毛竹-闊葉混交林和尚未被毛竹入侵的次生闊葉林樣地,每種林分各設置4個標準樣地(20 m×20 m),樣地之前間隔不小于20 m。

1.2 試驗設計

1.2.1野外凋落物置換試驗

2019年3月在上述次生闊葉林和毛竹純林的每個標準樣地內,隨機設置3個2.5 m×2.5 m的小區,小區與小區之間間隔不少于10 m；每個樣地內的3個小區對應3種凋落物輸入類型,本研究添加的凋落物包含葉凋落物和枯落細枝。小區建立時,清除小區內全部凋落物,保持一致狀態下緩沖3個月。小區設置時具體處理措施如下：四周埋設4根1 m高的PVC管；靠近地面圍設0.5 m高的尼龍網,防止周圍的凋落物進入小區內；頂部用尼龍網覆蓋,以阻止上方凋落物落入小區內,同時在小區邊緣設置0.5 m的緩沖帶。兩種林分每個樣地的3個小區內隨機布設對照、去除地上凋落物、置換凋落物3種處理(詳細說明見表1),每種林分的4個標準樣地作為4次重復,兩種林分共計24個小區。2019年5月起將頂部尼龍網上收集到的凋落物混勻后,等量均勻地添加到對照與置換處理的小區內,凋落物處理每個月進行1次。

表1 凋落物處理實驗設置Table 1 The experimental setup for litter treatment

1.2.2室內氮素礦化培養試驗

為了闡述凋落物輸入對土壤氮素礦化的影響,對上述實驗小區內采集的土壤樣品,進行為期7天的室內氮素礦化培養試驗。同時為了探討凋落物輸入改變后真菌和細菌群落對土壤氮素礦化相對貢獻的變化,對野外采集的毛竹林和闊葉林對照和置換土壤樣品進行添加鏈霉素(抑制細菌)和放線菌酮(抑制真菌)抑制劑處理。添加抑制劑處理具體為：(1)對照,土壤中不加任何抗生素；(2)放線菌酮,2 mg/g的放線菌酮注入裝有10 g土壤的培養瓶；(3)鏈霉素,1 mg/g的鏈霉素注入裝有10 g土壤的培養瓶；(4)放線菌酮+鏈霉素,2.0 mg/g的放線菌酮和1 mg/g的鏈霉素注入裝有10 g土壤的培養瓶。

1.3 樣品的采集與處理

1.3.1土壤樣品采集

在凋落物處理后3個月即2019年8月25日,五點取樣法用土鉆采集0—20 cm的土壤樣品,采集土壤樣品時盡量保持各采樣點的采樣量一致。將土壤樣品放入冰盒帶回實驗室,挑出石子和細根后混勻過2 mm的篩。過篩后的土壤樣品分為兩份；一份經含水量和持水量測定后,置于室內自然風干,磨碎過篩后用于測定土壤理化性質；另一份保存在4℃冰箱,用于室內氮素礦化培養試驗。

1.3.2凋落物收集

在第一次進行凋落物置換處理時,根據實驗處理將同一林分各小區凋落物收集網上的凋落物收集后混勻并稱重,一部分凋落物按每月的凋落物添加量均勻撒入對照和置換處理的小區內,另一部分裝入無菌自封袋,帶回實驗室在65℃(48 h)烘干直至恒重。稱重后使用粉碎機將其粉碎,過0.15 mm篩用于測定木質素、纖維素、全碳(TC)、全氮(TN)的含量。

1.4 指標測定

1.4.1土壤理化性質和凋落物化學性質測定

土壤化學性質的測定參照《土壤農業化學分析方法》[26]。復合電極方法測定土壤pH值,水土比為2.5∶1；重鉻酸鉀法-外加熱法測定土壤有機碳(Soil organic carbon,SOC)；凱氏定氮儀-蒸餾法測定土壤全氮；靛酚藍-比色法測定銨態氮；紫外分光光度計-比色法測定硝態氮。

凋落物化學性質測定,采用酸水解法測定纖維素和木質素含量[27]；重鉻酸鉀法-外加熱法測定凋落物全碳[26]；凱氏定氮儀-蒸餾法測定凋落物全氮[26]。

1.4.2土壤凈氨化、凈硝化速率測定

土壤凈硝化速率=(培養后的硝態氮含量-培養前的硝態氮含量)/培養天數；

土壤凈氨化速率=(培養后的銨態氮含量-培養前的銨態氮含量)/培養天數；

土壤凈氮礦化=[(培養后的銨態氮+硝態氮含量)-(培養前的銨態氮+硝態氮含量)]/培養天數

1.5 數據處理

使用SPSS 18.0統計軟件對數據進行統計分析,使用ANOVA單因素方差分析、Duncan和最小顯著性差異法(LSD),對土壤化學性質以及凋落物的化學性質進行顯著性分析與多重比較(P<0.05)。通過一元線性回歸評估土壤氮礦化速率與凋落物化學性質和土壤理化性質之間的相關性。采用Origin 2017軟件進行作圖。

2 結果與分析

2.1 兩種林分凋落物化學性質及凋落物處理對土壤理化性質的影響

由表2可知,與闊葉林(EBF)相比,毛竹林(PEF)凋落物全氮、木質素含量、木質素/全氮及木質素/纖維素分別高12.1%、33.4%、19.0%、69.5%,但纖維素含量低26.6%。

表2 兩種林分凋落物化學性質Table 2 Chemical properties of litters in two forests

由表3可知,兩種林分在未進行凋落物處理前,毛竹林土壤pH和全氮含量均顯著高于闊葉林土壤,而C/N、銨態氮、硝態氮含量均顯著低于闊葉林土壤。兩種林分去除凋落物后,與對照相比,毛竹林土壤全氮和硝態氮含量分別增加了28.6%、77.2%,而有機碳、C/N分別下降27.7%、60.2%。兩種林分置換凋落物后,與對照相比,闊葉林土壤C/N增加17.9%,全氮、銨態氮含量分別下降18.2%和9.1%；毛竹林土壤C/N增加27.6%,銨態氮下降19.6%。

表3 兩種林分凋落物處理對土壤理化性質的影響Table 3 Effects of litter treatment of two forest stands on soil physicochemical properties

2.2 兩種林分凋落物處理和抑制劑添加對土壤凈氮礦化速率的影響

由圖1可知,闊葉林凋落物去除和毛竹林凋落物去除處理后,與各自的對照相比,土壤凈氨化速率分別增加27.0%和23.4%。凋落物置換處理并未對毛竹林土壤的氨化速率造成影響,但毛竹林凋落物置換到闊葉林后土壤凈氨化速率增加43.8%。為了進一步闡明置換凋落物前后真菌和細菌對土壤凈氨化的貢獻,分別選擇兩種林分各自的對照和置換處理進行抑制劑添加試驗。在闊葉林對照土壤中添加抑制劑與未添加抑制劑相比,添加鏈霉素使土壤凈氨化速率下降117.5%；添加放線菌酮使土壤凈氨化速率顯著升高72.0%；同時添加放線菌酮和鏈霉素則無顯著差異。在闊葉林凋落物置換土壤中添加抑制劑與未添加抑制劑相比,添加鏈霉素和放線菌酮后土壤凈氨化速率分別下降70.0%、51.1%,同時添加放線菌酮和鏈霉素之后,土壤凈氨化速率無明顯差異。在毛竹林對照土壤中添加放線菌酮及同時添加放線菌酮和鏈霉素后,與未添加抑制劑相比土壤凈氨化速率分別升高67.2%、43.8%；但添加鏈霉素處理對土壤凈氨化速率無明顯影響。在毛竹林凋落物置換土壤中添加放線菌酮及同時添加放線菌酮和鏈霉素后,與未添加抑制劑相比土壤凈氨化速率分別升高60.6%、45.8%；但添加鏈霉素對土壤凈氨化速率無明顯影響(圖1)。

圖1 毛竹林和闊葉林凋落物處理及抗生素添加對土壤凈氨化速率的影響Fig.1 Effects of litter treatment and antibiotic addition on soil net ammonification rate in Moso bamboo and broadleaved forests

由圖2可知,凋落物去除使闊葉林土壤凈硝化速率下降11.4%,但對毛竹林土壤凈硝化速率無明顯影響。毛竹林凋落物置換處理與其對照相比,土壤凈硝化速率增加73.1%；但闊葉林凋落物置換處理與其對照相比,土壤凈硝化速率降低33.5%。在闊葉林對照土壤中添加抑制劑與未添加抑制劑相比,添加鏈霉素和放線菌酮使土壤凈硝化速率分別下降171.5%、139.2%；同時添加鏈霉素和放線菌酮后土壤凈硝化速率則無明顯差異。闊葉林置換土壤中添加抑制劑與未添加抑制劑相比,添加放線菌酮使土壤凈硝化速率下降104%,但添加鏈霉素、同時添加放線菌酮和鏈霉素使土壤凈硝化速率分別升高23.5%、31.1%。毛竹林對照土壤中添加抑制劑與未添加抑制劑相比,添加放線菌酮使土壤凈硝化速率下降27%；添加其它抑制劑處理均對土壤凈硝化速率無顯著影響。毛竹林凋落物置換土壤中添加抑制劑與未添加抑制劑相比,添加放線菌酮、鏈霉素使土壤凈硝化速率分別下降82.8%、102.1%；但同時添加放線菌酮和鏈霉素對土壤凈硝化速率無顯著影響。

圖2 毛竹林和闊葉林凋落物處理及抗生素添加對土壤凈硝化速率的影響Fig.2 Effects of litter treatment and antibiotic addition on soil net nitrification rate in Moso bamboo and broadleaved forests

總體而言,凋落物去除和置換對闊葉林土壤中凈氮礦化速率無明顯影響；但毛竹林土壤中與對照相比,凋落物去除、置換后凈氮礦化速率分別增加了17.4%、24.4%(圖3)。

圖3 毛竹林和闊葉林凋落物處理對土壤凈氮礦化速率的影響Fig.3 Effects of litter treatment on soil net mineralization rate in Moso bamboo and broadleaved forests

2.3 兩種林分土壤氮素礦化速率的影響因素分析

由表4可知,闊葉林土壤中凈氨化速率與凋落物纖維素含量呈負相關,與凋落物木質素/纖維素呈正相關；土壤凈硝化速率與凋落物纖維素含量呈正相關,與凋落物木質素/纖維素呈負相關。在毛竹林土壤中,凈硝化速率僅與凋落物木質素/纖維素呈負相關。

表4 兩種林分凋落物化學性質與土壤氮素礦化速率之間的線性回歸關系Table 4 Linear regression relationship between litter chemical properties and soil nitrogen mineralization rate in two forest stands

由表5可知,在闊葉林土壤中,凈氨化速率與土壤理化性質無相關性,但凈硝化速率與全氮、C/N呈正相關。在毛竹林土壤中,凈氨化速率與全氮呈正相關,與有機碳和C/N呈負相關；凈硝化速率與C/N呈正相關,與全氮呈負相關。

表5 兩種林分土壤化學性質與氮素礦化速率之間的線性回歸關系Table 5 Linear regression relationship between soil chemical properties and nitrogen mineralization rate in two forest stands

3 討論

凋落物是土壤有機質的重要來源[28],去除凋落物使土壤碳輸入方式發生改變,且通過改變土壤理化性質來影響土壤氮素礦化[29]。在本研究中,凋落物去除和置換對兩種林分土壤凈氮礦化速率產生的影響截然不同；去除凋落物后發現兩種林分土壤凈氨化速率顯著升高,即銨態氮凈生產增加,這與以往研究中去除凋落物使土壤銨態氮含量下降的結果[30]不一致。其原因可能與凋落物中木質素含量有關,木質素能夠降解為酚類化合物,這些化合物與植物蛋白質和氨基酸結合,形成抗腐爛的聚合物,因此木質素含量過高則凋落物降解速率減慢,最終會降低土壤凈氨化速率[31—32]。本研究中毛竹林和闊葉林凋落物木質素占比分別達到34%和25%,相對較高的木質素含量不利于土壤凈氨化過程,因此兩種林分土壤在無凋落物輸入的情況下促進了凈氨化過程。纖維素作為凋落物中主要的聚合物組分,是影響森林凋落物分解程度的關鍵調節因子[33],纖維素含量高低也會影響土壤凈氨化[34]。本研究中置換凋落物后闊葉林土壤凈氨化速率升高,且凈氨化速率與纖維素含量呈負相關。可見闊葉林土壤中凈氨化速率升高是由于毛竹林凋落物纖維素含量低于闊葉林凋落物,因此毛竹林凋落物置換到闊葉林中促使土壤凈氨化速率升高。

凋落物質量是影響土壤凈硝化速率的重要因素之一[35],不同類型凋落物的質量對土壤凈硝化速率的影響均存在差異[20]。本研究中置換凋落物處理使毛竹林土壤凈硝化速率顯著升高,但在闊葉林土壤中凈硝化速率則顯著下降。此結果與以往研究中置換凋落物處理對土壤凈硝化速率無顯著影響的報道[35]不一致。存在不一致的原因可能與凋落物化學性質和分解的主客場效應有關,本研究發現毛竹林凋落物的木質素含量、木質素/纖維素較高,土壤中能夠分解這些不易被降解的化學組分的微生物相對較少,闊葉林土壤中多樣性更高的真菌等降解群落更加有利于難降解組分分解[22]。本研究中線性回歸分析也表明,不論闊葉林還是毛竹林土壤中凈硝化速率均與凋落物木質素/纖維素呈負相關?？梢姷蚵湮镏脫Q后毛竹林土壤凈硝化速率增加,是由于闊葉林凋落物木質素/纖維素低于毛竹林凋落物,從而增加了毛竹林土壤中凈硝化速率,闊葉林土壤則反之。本研究中去除凋落物使闊葉林土壤凈硝化速率顯著下降,其原因可能與有機質中難分解和易分解組分的相對數量影響了土壤氮素礦化有關[36]。Wen等[37]研究表明土壤硝化速率與土壤C/N呈正相關,即土壤C/N越低土壤凈硝化速率也越低。線性回歸分析表明兩種林分土壤C/N與凈硝化速率呈正相關,暗示去除凋落物處理導致闊葉林土壤凈硝化速率降低的主要因素可能是土壤C/N。

土壤微生物控制著土壤氮的礦化過程,真菌和細菌是土壤中重要的微生物類群,但它們對土壤凈氨化速率的貢獻并不相同[38]。使用放線菌酮和鏈霉素等抗生素是研究細菌和真菌功能差異的成熟方法,在短期實驗中能夠對目標群體進行選擇性抑制[39]。本研究在闊葉林對照土壤中抑制細菌群落發現土壤凈氨化速率顯著降低,抑制真菌群落后則土壤凈氨化速率無顯著變化,表明在闊葉林對照土壤中細菌對凈氨化速率的相對貢獻大于真菌。但凋落物置換后改變了闊葉林中真菌和細菌群落對土壤凈氨化速率的相對貢獻,除細菌外真菌群落同樣對闊葉林土壤凈氨化起主導作用。其原因可以從以下兩個方面解釋：首先,與置換處理改變凋落物質量有關,真菌在分解凋落物木質素和纖維素組分中起重要作用[40],尤其在分解木質素中占有優勢[41]。本研究中毛竹林凋落物木質素含量和木質素/纖維素均顯著高于闊葉林。其次,以往的研究表明,凋落物木質素含量高的土壤中真菌比較豐富,凋落物分解過程中存在較強的主場效應[10]。而在本研究中,闊葉林凋落物中的木質素含量較低,因此闊葉林中凋落物置換處理后,真菌群落對土壤凈氨化速率的相對貢獻增加。本研究中添加放線菌酮和同時添加放線菌酮和鏈霉素促進了毛竹林對照和置換處理中的土壤凈氨化速率。其原因可能是因為抗生素添加后使真菌和細菌以外的群體受到抑制,而主要菌群受到抗生素和死亡微生物額外碳和氮的刺激[16],從而導致添加抑制劑后土壤凈氨化速率升高。

放線菌酮和鏈霉素也能選擇性抑制土壤凈硝化速率[16]。本研究在毛竹林對照土壤中添加放線菌酮使土壤凈硝化速率顯著降低,添加鏈霉素則無顯著變化；但凋落物置換后,抑制真菌和細菌都會使土壤凈硝化速率降低,表明置換凋落物后除真菌外細菌群落也在土壤凈硝化速率中發揮了作用。其原因可能與凋落物中的纖維素含量有關,有研究表明真菌和細菌都能夠分解纖維素,并且細菌的變化主要與纖維素的分解有關[40, 42]。本研究中闊葉林凋落物纖維素含量高于毛竹林,因此置換凋落物后細菌在土壤凈硝化中同樣發揮了主要作用。本文的抗生素抑制實驗也表明,真菌和細菌群落在闊葉林對照土壤凈硝化過程中發揮作用；然而凋落物置換后,只有真菌在土壤凈硝化中發揮主要作用。其原因可能是由于真菌群落是分解木質素的主要微生物類群[41],有研究表明凋落物中的木質素含量與真菌生物量呈顯著正相關[43]。本研究中,與闊葉林凋落物相比,毛竹林凋落物的纖維素含量低但木質素含量高,因此置換凋落物后真菌群落可能在闊葉林土壤凈硝化中發揮了主導作用。

4 結論

本研究采用野外控制試驗和室內培養相結合的方法探討毛竹入侵闊葉林生境中,凋落物處理對土壤氮素礦化的影響以及真菌和細菌對氮素礦化的相對貢獻。結果表明,去除凋落物改變了兩種林分土壤的凈氨化和凈硝化速率,去除凋落物后兩種林分的土壤凈氨化速率升高,而闊葉林土壤凈硝化速率降低,證實凋落物輸入直接調控了兩種林分土壤氮素礦化過程。另外,本文從凋落物質量的角度,探討了兩種林分凋落物處理后土壤凈氨化和凈硝化速率的變化,結果表明置換凋落物后,凋落物纖維素含量與闊葉林土壤凈氨化速率呈負相關；兩種林分土壤中凈硝化速率均與凋落物木質素/纖維素呈負相關?？梢娒窳值蚵湮镙斎胧逛@態氮凈生產增加,闊葉林凋落物輸入使硝態氮凈生產增加。特別是兩種林分凋落物木質素和纖維素含量的差異,使得真菌和細菌對土壤凈氨化和凈硝化的相對貢獻發生改變。本文解析了凋落物質量在毛竹擴張改變土壤氮素礦化中起到的重要作用,未來的研究需要在更長時間尺度上探討凋落物輸入改變土壤氮素礦化的過程,為闡明毛竹入侵闊葉林的地下生態機制提供理論依據。