放牧和刈割對大針茅草原土壤微生物群落結構及多樣性的影響

鄭佳華,趙萌莉,*,王 琪,張 峰,張 彬 ,張 軍

1 內蒙古農業大學草原與資源環境學院,呼和浩特 010019 2 內蒙古農業大學草地資源教育部重點實驗室,呼和浩特 010019 3 內蒙古農業大學理學院,呼和浩特 010019

大針茅草原是歐亞草原中最常見,最具代表性和最穩定的典型草原群落,廣泛分布于我國內蒙古中東部[1]。有研究表明,我國內蒙古錫林郭勒盟74.0%的大針茅草原處于退化狀態,嚴重威脅著畜牧業生產和當地牧民的生計[2]。放牧和刈割是該地區最普遍的利用方式,也是造成草地退化的主要原因[3],過度放牧會對草地生態系統造成許多負面影響,包括有毒植物的增加以及植被覆蓋度和生物量的損失、破壞植物群落的結構和組成、導致土壤環境惡化等[4—5],宋潔等的研究發現,重度放牧導致大針茅草原優勢種重要值降低,并且顯著降低了土壤養分含量[6],此外,土壤含水量、草地蒸散速率、土壤有機碳含量和土壤呼吸速率均與放牧強度呈負相關,說明放牧對草地生態系統功能有負效應[7]。另一方面,刈割顯著降低大針茅草原的產量和土壤氮含量[8],也導致土壤中營養元素的流失,降低生態系統的穩定性[9—10]。

土壤是一個復雜的生態系統,可以提供植物生長所需的水分和養分,是生物地球化學循環的基礎[11]。草地退化會導致沙漠化,并降低微生物數量[12]。土壤微生物是草地生態系統的重要組成部分,參與多種重要的生態功能,在調節碳氮循環等生物地球化學過程中發揮著重要作用[13]。不同的微生物在土壤養分循環中發揮不同的功能,如分解有機質和凋落物等[14]。有研究發現,人為干擾導致的草地植被群落的變化改變了一些土壤細菌的代謝,導致其對植物生長有害[15]。同時,生物和非生物因素,如凋落物輸入、土壤物理性質和土壤養分狀況可以調控微生物種群數量、群落結構和活性[16]。因此,不同利用方式下大針茅草原土壤養分狀況和環境因子的變化可能導致微生物群落結構和組成的變化,這一研究對于草地管理和健康評價具有重要意義。

目前有關大針茅草原長期放牧和刈割下對土壤微生物群落的研究較少,因此本研究采用高通量測序技術,旨在研究大針茅草原在不同利用方式下土壤微生物組成及多樣性的變化,并結合土壤理化因子進一步探究土壤微生物群落組成的主要影響因素。闡明土壤微生物群落組成的驅動因素,為大針茅草原合理利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 研究區概況

研究區位于內蒙古錫林浩特市毛登牧場(116.03°—116.50°E、44.80°—44.82°N)。該地區屬溫帶干旱大陸性氣候,氣溫變化劇烈,晝夜溫差較大。年平均氣溫2.25℃,年降水量136—387mm,年平均降水量281.39mm；年蒸發量2000—2700mm。大部分降水集中在6—9月,占全年降水量的80%以上。光照、熱、降水同期出現。土壤以栗鈣土為主,土壤有機質含量2%—3%。該地區以大針茅(Stipagrandis)為建群種,優勢種有羊草(Leymuschinensis)和知母(Anemarrhenaasphodeloides),主要伴生種有黃囊苔草(Carexkorshinskyi)、黃花黃芪(Astragalusluteolus)、冰草(Agropyroncristatum)以及冷蒿(Artemisiafrigida)等。

1.2 試驗設計

本研究選擇刈割(M)以及自由放牧(G)兩種利用方式,并以圍封作為對照(E),各個樣地在地形地貌、土壤組分、氣候及原生群落組成與類型上基本一致。其中刈割樣地和圍封樣地位于毛登牧場天然打草場試驗地,實驗樣地于2011年開始處理,設置了刈割處理區和圍封對照區,3次重復,共6個小區,每個小區面積為50m×30m,小區間隔10m,每年的8月31號使用打草機對刈割樣地進行割草處理,留茬高度約為5cm。放牧樣地選擇毛登牧場中利用強度相近的3戶牧民草場,面積分別為533、500、400hm2,全年自由放牧,主要放牧家畜為綿羊,放牧年限超過20年,2014—2020年使用移動圍籠測定3戶草地的7年平均草地利用率為60.9%[17]。

1.3 土壤取樣

野外取樣于2020年8月10—20日生物量高峰期進行。在刈割和對照樣地各個重復小區內隨機設置3個1m×1m的樣方,3個家庭牧場各隨機設置3個1m×1m的樣方,使用內徑7cm的根鉆在每個樣方內以“S”形5點混合采樣法收集0—20cm土層的土壤并裝入根袋中,篩出土壤樣品分成2份保存,一份放在4℃冰盒中帶回實驗室用于土壤微生物高通量測定,另一份帶回實驗室風干后用于土壤理化性質指標的測定。完成土壤樣品采集后,在每個小區內使用快速檢測溫度計隨機測定3處20cm深度的土壤溫度,計算平均值記為該小區的土壤溫度,使用烘干稱重法測定土壤含水量。

1.4 土壤微生物DNA提取及測序

將低溫保存的土壤樣品按每個區組混合成為1個樣品,使用MOBIO土壤DNA提取試劑盒(德國QIAEN公司)提取土壤微生物總DNA。將得到的DNA溶液利用紫外分光光度計和瓊脂糖凝膠電泳儀檢測濃度和樣品完整性(瓊脂糖凝膠濃度：1%；電壓：150V；電泳時間：40分鐘)。當用Nanodrop 2000測定DNA樣品的A260/A280比值均接近于1.8時,表明所提取DNA無降解,質量較好,可用于后續的PCR擴增實驗。PCR擴增細菌16S rRNA V3-V4高變區：515F(5′-gtgccagcmgccgcggtaa- 3′)、806R(5′-ggac-TACHVGGGTWTCTAAT- 3′),使用真菌引物組ITS5- 1737F和ITS2- 2043R擴增ITS1可變區。在2%瓊脂糖凝膠中檢測PCR產物,以確定擴增的成功率和條帶的相對強度。使用TruSeq? DNA PCR-Free Sample Preparation Kit 進行文庫構建。測序工作由“北京諾禾致源科技股份有限公司”完成。基于IonS5TMXL測序平臺,利用單端測序的方法,構建小片段文庫進行單端測序。測序完成后,對原始數據進行剪切、過濾、拼接得到有效數據用于后續分析,在97%相似性水平下將優質序列聚類成為OTUs(Operational taxonomic units),然后對OTUs序列進行物種注釋。使用Qiime軟件計算Observed-otus指數、Chao1指數、Shannon-wiener指數、Simpson指數、ACE指數,用于分析土壤微生物群落α多樣性[17]。

1.5 土壤理化性質測定

土壤全碳、全氮使用元素分析儀測定；土壤全磷使用鉬銻抗比色法測定；土壤銨態氮、硝態氮使用連續流動分析儀AA3測定；土壤有機碳使用重鉻酸鉀容量法-外加熱法測定；土壤有效磷使用0.5mol/L NaHCO3法測定；土壤電導率使用電導儀測定；土壤pH使用pH計測定。以上指標均嚴格按照土壤農化分析手冊中的實驗步驟測定[18]。

1.6 數據分析

使用Excel 2010初步整理數據,使用SPSS 20.0對實驗數據進行正態分布檢驗和方差齊性檢驗,本試驗的數據均符合正態分布且通過了方差齊性檢驗,對數據進行差異顯著性檢驗(DUNCAN法,α=0.05)。使用Origin 2019作圖。使用canoco 5.0軟件進行冗余分析。

2 結果分析

2.1 土壤理化性質

由表1可以看出,利用方式對土壤養分含量有顯著影響,與圍封相比,放牧顯著降低了土壤硝態氮、有效磷、有機碳、總氮和總碳含量,而刈割顯著提高了土壤總氮和總碳含量(P<0.05)。說明刈割有利于大針茅草原土壤養分的累積,而放牧則導致了土壤養分流失嚴重。同時,利用方式對土壤物理性質也有顯著影響,與圍封相比,放牧顯著降低了土壤含水量、溫度和pH,而刈割顯著提高了土壤pH(P<0.05)。

表1 不同利用方式下土壤理化特性Table 1 Physical and chemical characteristics of soil under different grassland management regime

2.2 OTU數量分析

根據不同利用方式下細菌、真菌的OTU數量繪制韋恩圖,由圖1可以看出,不用利用方式下共有細菌OTU2959個,圍封樣地特有的OTU數為762個；刈割樣地為749個；放牧樣地為974個,不用利用方式下共有真菌OTU559個,圍封樣地特有的OTU數為316個；刈割樣地為368個；放牧樣地為440個,可以看出土壤細菌數量遠大于真菌數量。此外,在放牧樣地中,特有的細菌OTU數和真菌OTU數均最大,說明在放牧下條件,土壤微生物群落變化最大,特有的微生物群落最多。

圖1 土壤樣品微生物 OTUs 數量的 16S(細菌)和 ITS(真菌)韋恩圖Fig.1 Venne diagram of OTUs number of bacteria and fungiOTUs: 操作分類單位 Operational taxonomic units

2.3 土壤微生物α多樣性分析

不同利用方式下土壤細菌群落的α多樣性指數間無顯著性差異,而土壤真菌群落的α多樣性指數間差異顯著(P<0.05)。其中,Observed_species指數、Chao1指數以及ACE指數的變化趨勢一致,與圍封相比,放牧無顯著影響,但是刈割顯著提高了土壤真菌群落的Observed_species指數、Chao1指數以及ACE指數(P<0.05),分別提高了7.24%、7.76%和8.13%(表2)。Observed_species指數表示真菌的物種數目,值越高表示該樣地內物種豐富度越高；Chao1指數表示樣地內真菌OTU數目；ACE指數表示樣地內真菌物種豐富度和均勻度。說明在刈割處理下,土壤真菌群落豐富度最高且物種分布最均勻。

表2 不同利用方式下土壤細菌和真菌α多樣性指數方差分析Table 2 Variance analysis of α diversity index of soil bacteria and fungi under different grassland management regimes

2.4 土壤微生物群落結構

不同利用方式下土壤細菌群落相對豐度在門水平上排名前10的菌群依次為：變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)、undefined_Bacterial、厚壁菌門(Firmicutes)、酸桿菌門(Acidobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、疣微菌門(Verrucomicrobia)、芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)、泉古菌門(Crenarchaeota)以及綠彎菌門(Chloroflexi),其中相對豐度排名前5的細菌群落占土壤細菌總OTU數的60%以上(圖2)。不同利用方式下土壤真菌群落相對豐度在門水平上排名前10的菌群依次為：子囊菌門(Ascomycota)、被孢霉門(Mortierellomycota)、擔子菌門(Basidiomycota)、壺菌門(Chytridiomycota)、霉門(Mucoromycota)、球囊菌門(Kickxellomycota)、梳霉門(Kickxellomycota)、羅茲菌門/隱菌門(Rozellomycota)、油壺菌門(Olpidiomycota)以及隱孢子菌門(Aphelidiomycota),其中子囊菌門(Ascomycota)和被孢霉門(Mortierellomycota)占土壤真菌總OTU數的70%以上(圖2)。

圖2 不同利用方式下土壤細菌和真菌群落在門水平上的相對豐度Fig.2 Relative abundance of total bacterial and fungi phyla in soil under different grassland management regimes細菌：Proteobacteria,變形菌門；Actinobacteria,放線菌門；Firmicutes,厚壁菌門；Acidobacteria,酸桿菌門；Bacteroidetes,擬桿菌門；Verrucomicrobia,疣微菌門；Gemmatimonadetes,芽單胞菌門；Crenarchaeota,泉古菌門；Chloroflexi,綠彎菌門；真菌：Ascomycota,子囊菌門；Mortierellomycota,被孢霉門；Basidiomycota,擔子菌門；Chytridiomycota,壺菌門；Mucoromycota,毛霉門；Glomeromycota,球囊菌門；Kickxellomycota,梳霉門；Rozellomycota,羅茲菌門/隱菌門；Olpidiomycota,油壺菌門；Aphelidiomycota,隱孢子菌門

通過MetaStat分析不同利用方式下土壤細菌的相對豐度在門水平上的差異性,共有6種細菌類群存在顯著性差異,分別是變形菌門、放線菌門、厚壁菌門、疣微菌門、芽單胞菌門以及綠彎菌門(圖3)。與圍封相比,放牧顯著提高了變形菌門、疣微菌門和芽單胞菌門的相對豐度(P<0.05),而圍封樣地與刈割樣地間無顯著差異；放牧和刈割顯著提高了放線菌門和綠灣菌門的相對豐度(P<0.05)；放牧和刈割顯著降低了厚壁菌門的相對豐度(P<0.05)。

圖3 不同利用方式下土壤門水平上主要細菌相對豐度的方差分析Fig.3 Variance analysis of relative abundance of major bacteria at soil phylum level under different grassland management regimes不同小寫字母表示處理間差異顯著(P<0.05)

土壤真菌群落的相對豐度在門水平上僅有擔子菌門差異顯著,與圍封相比,刈割顯著增加了擔子菌門相對豐度(P<0.05),而圍封樣地與放牧樣地間無顯著差異(圖4)。

圖4 不同利用方式下土壤門水平上主要真菌相對豐度的方差分析Fig.4 Variance analysis of relative abundance of major fungi at soil phylum level under different grassland management regimes

2.5 土壤微生物群落結構與土壤理化性質的關系

使用冗余分析(RDA)進一步分析土壤理化性質與土壤微生物群落結構的影響,圖5為土壤細菌群落與土壤理化性質的RDA分析,RDA的前兩個軸分別解釋了總方差的74.38%和10.74%,共解釋了85.12%,說明RDA的結果可靠,蒙特卡洛檢驗的結果表明,土壤硝態氮(P=0.024)和銨態氮(P=0.046)是影響土壤細菌群落最主要的因素(表3),由圖5可以看出,二者均與酸桿菌門呈正相關,與變形菌門呈負相關；而土壤電導率與變形菌門呈正相關；土壤含水量與擬桿菌門呈正相關。

圖5 土壤細菌群落與土壤理化性質的冗余(RDA)分析 Fig.5 RDA analysis of soil bacterial community and soil physicochemical propertiesEC:電導率 Electrical conductivity；SM: 土壤含水量Soil moisture；AP: 有效磷Available phosphorus；ST:土壤溫度Soil temperature；SOC: 有機質Soil organic carbon；TC: 全碳Total 銨態氮Ammonium 硝態氮Nitrate nitrogen

表3 經冗余分析確定土壤理化性質對土壤微生物群落結構的影響Table 3 The effects of soil physical and chemical properties on soil microbial community structure were determined by redundancy analysis

圖6為土壤真菌群落與土壤理化性質的RDA分析,RDA的前兩個軸分別解釋了總方差的71.08%和26.72%,共解釋了97.8%,說明RDA的結果可靠,蒙特卡洛檢驗的結果表明,土壤有效磷(P=0.06)和硝態氮(P=0.024)是影響土壤真菌群落最主要的因素,由圖6可以看出,土壤有效磷、硝態氮、pH、銨態氮等理化性質與被孢霉門和擔子菌門呈正相關,與子囊菌門和油壺菌門呈負相關。冗余分析的結果表明,土壤細菌和真菌對土壤理化性質的響應結果和敏感程度不同。

圖6 土壤真菌群落與土壤理化性質的RDA分析Fig.6 RDA analysis of soil fungal community and soil physicochemical propertiesTP:全磷Total phosphorus；TN: 全氮Total nitrogen

3 討論

3.1 利用方式對土壤理化性質的影響

放牧和刈割作為大針茅草原最主要的利用方式,對草地生態系統起到至關重要的作用,放牧主要通過家畜的糞尿和踐踏影響草地養分循環[19],而刈割則是通過均勻的去除植物地上部分影響草地生態系統[20]。本研究表明,放牧顯著降低了土壤總碳、總氮、有機碳含量,而刈割顯著提高了土壤總碳含量,大針茅草原主要由多年生牧草,如大針茅、糙隱子草、羊草等組成,這些植物具有較高的地下生物量分配用于根系的發育,以便為來年植物的生長存儲養分,因此,高強度放牧提高了植物地下碳的分配和對土壤碳的吸收,導致土壤有機碳含量下降[21—22]。植物殘渣的分解是土壤碳儲量的主要來源之一,而刈割仍會有少量植物殘渣歸還與土壤,并且刈割會導致植物根部死亡率提高,有利于土壤碳儲量累積[23],同時,刈割有利于更多的微生物降解不穩定的有機碳,增加有機碳輸入[24]。土壤氮素的輸入主要取決于植物殘渣返回土壤,還有一小部分來自大氣沉積[25],張峰等人的研究表明,放牧顯著降低凋落物量[26],導致草地養分返回減少,固氮能力下降,另一方面,放牧家畜的排泄物主要集中在棚圈中,也導致土壤氮素流失嚴重。此外,與銨態氮相比,植物主要吸收利用土壤中的硝態氮[25],長期放牧條件下,植物對土壤硝態氮的持續吸收以及固氮能力的不足導致其含量顯著降低。土壤有機質分別通過在低養分條件下供應和在高養分條件下儲存養分來發揮緩沖作用,并有助于將可溶性養分的可用性與植物需求同步,通過這種緩沖機制維持草地生態系統的碳、氮循環,但在重度放牧下,土壤有機質含量的顯著降低導致碳、氮循環失衡[27],此外,放牧下土壤碳、氮損失可歸因于土壤微生物群落結構的改變導致較低的真菌與細菌的比例[28—29]。

放牧對土壤物理性質的影響主要歸因于動物踐踏[30—31],隨著放牧強度的增加,頻繁的擾動可能會超過土壤的自然恢復能力,導致土壤結構惡化,進而導致水分滲透能力降低,同時,凋落物和植被蓋度的降低導致裸露土壤的面積增加,從而增加日溫度波動和日最高溫度,進而導致土壤水分蒸發率更高[32],這些原因均導致放牧樣地中土壤含水量顯著降低[33]。本研究發現,放牧顯著降低土壤pH,放牧導致根系分泌物和土壤呼吸產生更多的碳酸和有機酸等酸性物質,導致土壤酸化[34],而刈割顯著提高土壤pH可能是由于刈割導致土壤有機氮的銨化作用增強,刈割下土壤銨態氮含量升高也證明了這一觀點[35]。在本研究中,土壤理化因子,包括土壤總碳、有機碳、總氮、銨態氮、硝態氮、有效磷、水分及pH存在顯著差異,這些差異可能導致了微生物群落結構和組成的差異。

3.2 利用方式對土壤微生物多樣性及群落結構的影響

土壤微生物作為土壤系統的重要組成部分,通過調節土壤有機質和植物凋落物的分解以及植物養分的可用性,在草地生態系統中發揮著重要作用。本研究表明,刈割對土壤細菌群落多樣性的影響有限,而土壤真菌多樣性對刈割的響應更顯著。刈割顯著提高了土壤真菌α多樣性,這一結果與Yu等人在高寒草甸的研究結果一致[36],可能是由于刈割后植物殘渣的累積有利于真菌的聚集；此外,也有研究表明,刈割顯著提高了叢枝菌根真菌的豐度和多樣性,進而提高了土壤真菌的多樣性[37]。而韋恩圖表明,在放牧樣地中特有的微生物OTU數最多,放牧條件下土壤受到的干擾最大,家畜的踐踏、采食作用、排泄物以及人類活動導致土壤條件發生顯著改變,進而導致微生物類群特異性最大[38]。

本研究區域內主要優勢細菌類群為變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)和酸桿菌門(Acidobacteria),主要優勢真菌類群為子囊菌門(Ascomycota)和孢霉菌門(Mortierellomycota)。不同利用方式下部分微生物類群的相對豐度差異顯著。放牧和刈割均顯著提高了放線菌門和綠灣菌門(Chloroflexi)的相對豐度,二者中有很大一部分細菌可以通過光合作用獲取能量并固定CO2[39—40],意味著其固碳能力提高,RDA分析結果也表明,土壤總碳和有機碳含量與放線菌門呈正相關關系,且放線菌門和綠灣菌門在有機物分解和營養循環中發揮重要作用。放牧和刈割均顯著降低了厚壁菌門(Firmicutes)的豐度,許多植物致病菌屬于厚壁菌門[41],說明刈割和放牧減小了土壤致病細菌對植物健康的威脅。放牧顯著提高了變形菌門的豐度,其被認為可以降解土壤中更多的頑固性有機質,如甲殼素等[42—43],說明放牧下草地退化伴隨著頑固性有機質輸入的增加。同時,放牧還顯著提高了疣微菌門(Verrucomicrobia)和芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)的豐度,二者均是主要參與土壤氮循環的微生物類群,與土壤氮含量呈負相關,與前人的研究結果一致[44],以上結果表明,具有營養物質降解功能和較高代謝活性的微生物在放牧下生存良好,這一現象證實了放線菌門和變形菌門等對放牧條件下大針茅草原的生境條件具有良好的適應能力。刈割顯著提高了擔子菌門(Basidiomycota)的相對豐度,這是一類主要功能為分解植物木質化殘渣的真菌類群,刈割后的植物殘渣的增加導致了富集[45]。

由于土地利用方式的改變對土壤結構及養分狀況的影響,土壤微生物組成也隨之變化[46]。我們的研究表明,土壤性質解釋了85.12%和97.8%的土壤細菌和真菌群落的變化,這表明微生物群落組成的變化與土壤性質有很大的相關性。RDA分析表明,土壤銨態氮和硝態氮含量是細菌群落最主要的影響因素,且與酸桿菌門呈正相關關系,酸桿菌門是一類寡營養型細菌,能利用銨態氮和硝態氮作為氮源[47],Yuan等也發現土壤銨態氮是影響青藏高原表層土壤細菌群落的主要環境因子,說明了土壤氮組分在細菌群落結構形成中的重要性[48]。土壤真菌群落主要受有效磷和硝態氮的影響,這一結果與Ding等的研究結果一致[49],土壤有效磷與真菌群落密切相關,說明土壤有效磷在建立土壤真菌群落中具有重要意義。本研究表明,細菌對銨態氮含量敏感,而真菌對硝態氮含量敏感,說明微生物對土壤不同形式氮的利用存在選擇性。綜上所述,不同利用方式下土壤微生物群落結構存在顯著差異,土壤銨態氮、硝態氮和有效磷是土壤微生物群落形成和演化的主要驅動因素。

4 結論

不同利用方式顯著改變了土壤微生物多樣性及群落結構,刈割顯著提高了土壤真菌α多樣性指數。放牧顯著提高了變形菌門(Proteobacteria)、疣微菌門(Verrucomicrobia)和芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)的相對豐度,刈割顯著提高了放線菌門(Actinobacteria)、綠灣菌門(Chloroflexi)及擔子菌門(Basidiomycota)的相對豐度,此外,放牧和刈割顯著降低了厚壁菌門(Firmicutes)的相對豐度。土壤理化性質共解釋了土壤細菌85.12%和真菌97.8%的變化,土壤細菌群落結構主要受硝態氮和銨態氮含量的影響,土壤真菌群落結構主要受有效磷和硝態氮含量的影響,土壤速效養分是不同利用方式下大針茅草原土壤微生物群落形成和演化的主要驅動因素。本研究揭示了不同利用方式下大針茅草原土壤微生物多樣性及群落結構的變化及其主要驅動因素,為大針茅草原合理利用提供了理論依據。