秸稈還田對玉米根際氨氧化微生物群落及紅壤硝化潛勢的影響

鄭 潔,程夢華,欒 璐,孔培君,孫 波,蔣瑀霽,*

1 土壤與農業可持續發展國家重點實驗室(中國科學院南京土壤研究所), 南京 210008 2 中國科學院大學, 北京 100049 3 南京師范大學生命科學學院, 南京 210023

根際微生物作為土壤生物群落中最活躍且具有決定性影響的組分之一,在土壤-植物生態系統中參與了土壤有機質等養分循環和能量流動。揭示植物—根際微生物根際對話過程及其調控機制,對促進植物生長發育和生產力的提高至關重要[1—2]。氮是陸地生態系統中控制植物生長的關鍵限制營養元素,根際土壤微生物驅動著土壤—植物系統中氮素循環過程,將氮素轉化為可被植物吸收的形態,滿足植物的氮素需求。硝化作用是土壤氮素形態轉化的關鍵步驟之一,我國農田生態系統硝化活性較高,以自養硝化作用為主[3—4]。作為自養硝化過程的氨氧化過程是第一和限速步驟,主要由含氨單加氧酶基因(amoA)的氨氧化古菌(ammonia-oxidizing archaea, AOA)和氨氧化細菌(ammonia-oxidizing bacteria, AOB)共同驅動,在有氧環境下將氨氧化為亞硝酸鹽[5]。近年來,全程氨氧化微生物(Comammox)的發現使人們對氮循環有了全新的認識,但是深入研究發現Comammox大都來自銨貧瘠的生境,而在高底物濃度的農田土壤硝化過程中典型的氨氧化微生物(AOA和AOB)扮演的角色并不能被Comammox所取代[6—7]。農田生態系統中,環境因子(pH、NH4濃度等)和農田管理措施(種植方式、施肥管理等)決定著土壤中氨氧化微生物的生態位分異,影響群落的豐度和硝化潛勢[8]。研究表明低pH和低NH4濃度條件下,AOA在氨氧化過程中發揮著主導作用,而AOB則傾向于主導中性和堿性土壤,以及高NH4濃度環境的氨氧化過程[9—10,11]。Wu等[12]和Su等[13]研究發現,不同的施肥管理方式會顯著影響AOA和AOB的群落結構。可見,研究AOA和AOB群落對農田管理措施和環境因子的響應機制一直是農田生態系統研究的熱點問題,對深入認識氮素轉化機制具有重要意義。

紅壤是中國南方地區的主要土壤類型,其分布地區氣候條件優越。由于紅壤酸性強,土質粘重,脫硅富鐵鋁化現象嚴重,導致土壤氮素供應失衡[11]。與此同時,農田過度施用氮肥,加劇土壤酸化,導致氮素轉化功能微生物豐度和代謝活性下降,降低了作物生產力和氮素養分利用率,同時還會對環境造成負擔[14]。研究表明,秸稈還田是培肥地力,改良土壤性狀的有效途徑之一。作為土壤養分和有機物質的重要來源,秸稈分解刺激了土壤微生物的活性,通過提高土壤氮素有效性加速氮素循環,促進作物生長發育[15]。但是秸稈還田存在腐解慢、與作物爭氮和土壤疏松等不利因素,導致作物出苗困難、誘發病蟲害等問題[16]。因此,揭示秸稈還田的高效激發效應,對建立貧瘠紅壤快速培肥的調控技術具有重要的實踐價值。

Tosti等發現秸稈豬糞配施通過調節秸稈中的碳氮比可以加快微生物的礦化作用,顯著提高有機氮的礦化與礦質氮的微生物固持,進而增加作物產量[17]。Yu等發現秸稈生物炭可以增加微孔生境的可用性,提高微生物生物量和多樣性[18]。不同秸稈還田方式對培育土壤肥力、增強功能微生物活性具有重要影響,但目前關于秸稈還田處理對根際氨氧化微生物群落和功能的影響機制尚不明確。為此,本研究以南方典型旱地紅壤為研究對象,依托秸稈還田長期定位試驗(9年),通過Illumina高通量測序技術,研究不同秸稈還田處理對玉米根際氨氧化微生物多樣性和群落結構、以及硝化潛勢的影響,旨在揭示不同秸稈還田處理對根際氮轉化微生物調控機制,以期為建立科學高效的秸稈還田措施、提高氮肥利用率提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 研究區概況

田間試驗于2010年設置在江西省鷹潭市中國科學院紅壤生態實驗站(116°55E,28°13N),屬中亞熱帶季風氣候,年平均氣溫17.8℃,年降水量約為1795 mm,其土壤為第四紀紅黏土發育的紅壤(黏化濕潤富鐵鋁土)。田間試驗小區面積為100 m2(5 m×20 m)。土壤酸性較強、有機質低。試驗地開始前表層土壤(0—20 cm)的基本理化性質為：pH 4.73,有機碳2.52 g/kg,全氮0.40 g/kg,全磷0.23 g/kg,堿解氮38.30 mg/kg,全鉀11.95 g/kg,速效磷0.76 mg/kg,速效鉀47.58 mg/kg,陽離子交換量12.12 cmol/kg。

1.2 試驗材料與設計

試驗共設置5個處理,分別為：不施肥(CK)；氮磷鉀肥(NPK)；氮磷鉀肥+秸稈(NPKS)；氮磷鉀化肥+秸稈豬糞配施(秸稈豬糞按9∶1的碳配比施用,NPKSM)；氮磷鉀肥+秸稈生物炭(NPKB)。試驗供試作物為玉米(ZeamaysL.,蘇玉24),每年4月份種植,7月份收獲。每個處理設置3個重復,隨機區組排列。秸稈生物炭是利用風干玉米秸稈在生物炭爐中450 ℃下通過厭氧悶燒制成。不同秸稈還田處理(NPKS、NPKSM、NPKB)每年的碳輸入量為1000 kg/hm2,各處理的化肥的施入量為：尿素(N, 150 kg/hm2),鈣鎂磷肥(P2O5, 75 kg/hm2),無機鉀肥(K2O, 60 kg/hm2),所有氮磷鉀肥、秸稈、豬糞和生物炭在玉米種植前一次性施入土壤并翻耕混勻。

1.3 樣品采集與土壤性質測定

1.4 高通量測序與熒光定量PCR分析

采用MoBio PowerSoil DNA(MIBIO laboratories Inc.,Carsbad,USA)試劑盒提取土壤樣品DNA。通過NanoDrop?ND- 2000檢測DNA濃度質量,然后進行1.2%(w/v)的瓊脂糖凝膠電泳,檢測DNA片段大小。AOA的擴增引物為Arch-amoA26F(5′-GACTACATATTCTACACWGACTGGGC- 3′)和Arch-amoA417R(5′-GGTGTCATATATGGAGGCAACGTTGG- 3′)；AOB的擴增引物為amoA- 1F(5′-GGGGTTTCTACTGGTGGT- 3′)和amoA- 2R(5′-CCCCTCKGSAAAGCCTTCTTC- 3′)。PCR反應體系為20 μL：2×SYBR Premix 10 μL,0.8 μL上下引物,1 μL DNA模板,加ddH2O補足。PCR擴增條件為：94℃預變性2 min,94℃變性30 s,55 ℃退火30 s,72℃延伸30 s,72℃終末延伸10 min,循環30次。PCR產物純化回收后制備測序文庫,通過Illumina Miseq平臺進行高通量測序。生物信息學分析采用Mothur軟件包對原始序列進行質量篩選,對保留的序列進行修剪。選擇與barcode完全匹配的序列,將其分配到古菌和細菌的amoA基因的單獨文件中。使用FrameBot工具進一步進行篩選后,采用RDP中FunGene數據庫對AOA和AOB的amoA進行相似度檢索。最后,對每個樣本的序列讀數進行聚類,使用CD-HIT-EST得出基于97%相似度的OTU[20]。

AOA和AOB的amoA基因拷貝數用熒光定量法測定,反應在ABI StepOne TM實時熒光定量PCR儀上進行。所用引物與上述相同,反應體系為：2×SYBR?Premix Ex Taq 10 μL,上下引物各0.5 μL,DNA模板1 μL,最后用ddH2O補至20 μL。反應程序為：95℃預變性1 min,94℃變性45 s,57℃退火45 s,72℃延伸45 s,72℃終末延伸10 min,重復循環40次。每個樣品3個重復,并設3個用無菌水作為空白對照。

1.5 氨氧化微生物功能的測定

1.6 數據處理

使用Chao 1指數表征豐富度,以Shannon指數表征多樣性。采用主坐標分析(principal co-ordinates analysis,PCoA)計算兩兩樣本間Bray-Curtis距離,研究樣本群落組成的差異性。相關性分析和方差分析等在SPSS 24.0中完成,不同處理之間利用Tukey法進行單因素方差分析,不同字母表示處理間差異顯著(P<0.05)。多元分析統計在Rstudio軟件中完成,其中微生物多樣性、主坐標分析(PCoA)和相似性分析(ANOSIM)通過vegan包完成。隨機森林分析通過randomForest程序包計算,并通過rfUtilities和rfPermute程序包分別檢驗模型和每個變量的P值。結構方程模型(SEM)在AMOS 23.0軟件中分析。

2 結果與分析

2.1 不同秸稈還田處理的土壤理化性質和硝化潛勢

圖1 不同秸稈還田處理的土壤硝化潛勢 Fig.1 Potential nitrification activity under treatments with straw returning誤差線表示標準誤；不同小寫字母表示PNAAOA和PNAAOB分別在各個處理間的差異顯著性(P<0.05);CK：不施肥；NPK：氮磷鉀肥；NPKS：氮磷鉀肥+秸稈；NPKSM：氮磷鉀肥+秸稈豬糞配施；NPKB：氮磷鉀肥+秸稈生物炭AOA:氨氮氧化古菌; AOB:氨氧化細胞

表1 不同秸稈還田處理的土壤理化性質(平均值±標準誤)Table 1 Soil physic-chemical properties under different straw returning treatments(Mean±SE)

2.2 不同秸稈還田處理的氨氧化微生物amoA基因豐度

通過熒光定量PCR對不同秸稈還田處理下土壤AOA和AOB的amoA基因拷貝數進行分析,結果表明,所有處理中AOA的amoA基因的平均拷貝數(2.6×106拷貝/g)顯著高于AOB(2.73×104拷貝/g)(P<0.05,圖2)。AOA的amoA基因拷貝數介于0.31×105—7.16×106拷貝/g,與NPK處理比較發現,NPKS、NPKSM和NPKB處理下AOA的amoA基因拷貝數分別增加了4.88、9.64和1.93倍。AOB的amoA基因拷貝數介于0.26×104—4.93×104拷貝/g之間,NPKS、NPKSM和NPKB處理下AOB的amoA基因拷貝數分別比NPK處理增加了4.36、3.93和5.42倍。NPKSM處理下AOA的amoA基因拷貝數最高,而NPKB處理下AOB的amoA基因拷貝數最高。

圖2 不同秸稈還田處理的AOA和AOB的amoA基因豐度Fig.2 The amoA gene abundance of AOA and AOB under treatments with straw returning不同小寫字母表示各處理間差異顯著(P<0.0)

2.3 不同秸稈還田處理的氨氧化微生物群落多樣性和結構特征

不同秸稈還田處理的AOA和AOB群落多樣性的Shannon和Chao1指數在各處理間均顯著改變(P<0.05,圖3)。與CK處理相比,NPK處理提高了AOA的Shannon和Chao1指數,但降低了AOB的Shannon和Chao1指數。與CK和NPK處理相比,NPKS、NPKSM和NPKB處理的AOA和AOB的群落多樣性指數均顯著增加(P<0.05),在AOA群落中,NPKB處理的Shannon指數最高,NPKS處理的Chao1指數最高；在AOB群落中NPKS處理的Shannon指數最高,NPKSM的Chao1指數最高。

圖3 不同秸稈還田處理的AOA和AOB群落的Shannon指數與Chao 1指數Fig.3 The Shannon indices and Chao 1 richness of AOA and AOB under treatments with straw returning

不同秸稈還田處理的AOA群落主要由Nitrosotalea(70.8%)、Nitrososphaera(25.1%)和Nitrosopumilus(0.24%)組成(圖4),系統發育分析結果表明NitrosotaleaCluster 1.1的相對豐度占70.8%,NitrososphaeraCluster 9的相對豐度占12.3%,其余主要由NitrososphaeraCluster 1.1(4.5%)、NitrososphaeraCluster 2(3.9%)和NitrososphaeraCluster 7.2(3.1%)組成,其中NitrosotaleaCluster 1.1的相對豐度在CK處理中最高(90.1%),NitrososphaeraCluster 2在NPKSM處理中相對豐度最高(8.5%),NitrososphaeraCluster 9在NPKB處理中的相對豐度最高(37.1%)。AOB群落主要由Nitrosospira組成,其中NitrosospiraCluster 9的豐度占61.9%,NitrosospiraCluster 3a豐度占18.3%,其余主要由NitrosospiraCluster 10(6.8%)、NitrosospiraCluster 3b(3.86%)、NitrosospiraCluster 9(1.9%)等組成,NitrosospiraCluster 9在CK處理中豐度最高(7.9%),NitrosospiraCluster 12在NPK處理中豐度最高(85.8%),NitrososphaeraCluster 3a在NPKSM處理中豐度最高(36.1%),NitrosospiraCluster 10在NPKB處理中豐度最高(21.3%)。主坐標分析發現(PCoA),PCoA1軸和PCoA2軸分別解釋了AOA群落結構45.27%和22.63%的差異,解釋了AOB群落結構44.49%和27.82%的差異(圖4)。不同秸稈還田處理下AOA和AOB群落結構在PCoA1軸和PCoA2軸上明顯分異,ANOSIM分析表明不同秸稈還田處理下AOA(r=0.752,P<0.01)和AOB(r=0.834,P<0.01)群落結構的組間差異顯著大于組內差異。

圖4 不同秸稈還田處理的AOA和AOB群落組成和結構Fig.4 The composition and structure of AOA and AOB under different straw returning treatments

2.4 土壤氨氧化微生物群落與理化性質、硝化潛勢的關系

圖5 土壤AOA和AOB群落與理化性質、硝化潛勢的Pearson相關系數Fig.5 Pearson correlation coefficients between soil properties, PNA and AOA and AOB communityamoA基因的拷貝數代表群落豐度(Abundance)；第一主坐標值(PCoA1)代表群落組成(Composition)；PNAAOA代表AOA群落的硝化潛勢；PNAAOB代表AOB群落的硝化潛勢,PNAAOA/AOB表示在AOA熱圖中是PNAAOA,而在AOB熱圖中是PNAAOB;*：P<0.05,**：P<0.01

圖6 隨機森林分析生物因子和非生物因子對土壤硝化潛勢(PNAtotal)的平均預測重要性；土壤硝化潛勢(PNAtotal)影響因子的結構方程模型Fig.6 Mean predictor importance (% of increased mean square error, MSE) of abiotic and biotic factors on PNAtotal based on random forest analysis; Structural equation modelling (SEM) to predict the influence factors of PNAtotal *： P<0.05,**： P < 0.01,***： P < 0.001;單項箭頭表示數據之間的因果關系,箭頭上的數字表示標準化的路徑系數,連線的粗細和路徑系數呈比例縮放。實線表示正相關,虛線表示負相關;Abundance: amoA基因的拷貝數,Diversity：群落的Chao 1指數, PNAtotal：AOA與AOB的總硝化潛勢

3 討論

3.1 不同秸稈還田處理對土壤理化性質和硝化潛勢的影響

3.2 不同秸稈還田處理對根際氨氧化微生物群落結構和多樣性的影響

3.3 不同秸稈還田處理對根際氨氧化微生物群落功能的影響

4 結論