瀾滄江兩條支流捕食線蟲真菌水陸分布差異及關聯性

張 欣,鄧 巍,朱婭佼,李 娜,*,肖 文,3,4,楊曉燕,3

1 大理大學東喜瑪拉雅研究院, 大理 671003 2 云南省高校洱海流域保護與可持續發展研究重點實驗室, 大理 671003 3 大理大學三江并流區域生物多樣性保護與利用云南省創新團隊, 大理 671003 4 中國三江并流區域生物多樣性協同創新中心, 大理 671003

闡釋生態系統中生物多樣性的分布格局和維持機制一直是生態學研究的核心問題,而微生物是地球上各生態系統物質循環的樞紐,是生物地球化學循環的關鍵類群[1—3],對微生物多樣性分布格局的認識成為了完善整個生物多樣性空間分布格局研究的關鍵。近年來,越來越多的研究證明了微生物多樣性存在明顯的地理分布差異[4—7],而造成這種差異的機制尚不清楚。為明晰微生物多樣性地理分布差異的形成機制,有研究者提出,微生物多樣性分布格局的研究可能應該基于流域開展[8]。

流域由水生生態系統和陸地生態系統共同組成[9],要闡釋微生物在其中的空間分布格局就必須同時考慮水生生態系統和陸地生態系統的相互關系。然而,一直以來,陸地都被認為是微生物的大本營,許多研究僅基于陸地開展[10—11]。另一些研究關注到了水生生態系統中的微生物[12—14],但之前的研究也只對比過水生和陸生類群的差異[15—16],水生和陸生物種多樣性被嚴格區分,兩者之間的相互關系被忽略。因此,對微生物在水陸生態系統中相互關系的長期忽視是造成微生物多樣性空間分布格局產生機制尚不明晰的原因之一。要厘清造成微生物多樣性分布差異的問題,就必須把水生和陸生生態系統聯系起來,同時,考慮到微生物超強的擴散能力和巨大的多樣性,相關研究還需要在環境異質性強的區域,進行系統的水陸對稱樣點布設,結合純培養和分子手段,開展定性和定量的測定。

捕食線蟲真菌是一類生態功能獨特、營養類型多樣、分離純化鑒定較為容易的真核微生物,現已知的物種僅106種[17—25],廣泛分布于全球各種水陸生境中。按照捕食器官類型,捕食線蟲真菌分為產黏性菌網的Arthrobotrys屬,產黏球、黏性分枝和非收縮環的Dactylellina屬,以及產收縮環的Drechslerella屬[17]。鑒于其分布廣泛、水陸兼有、分離純化和鑒定又較為容易的特性[26—27],以捕食線蟲真菌開展微生物水陸分布格局研究具有獨特的優勢,厘清其水陸關系對于明晰整個微生物類群的水陸分布模式有重要的借鑒意義。因此,本研究選擇高環境異質性的瀾滄江支流為研究區域,在沘江和黑惠江兩支流范圍內采集水流匯入點及其上下游水陸對稱樣點的土壤樣品,結合傳統形態學和分子生物學方法分離鑒定捕食線蟲真菌,探究捕食線蟲真菌物種多樣性在瀾滄江支流水、陸間的分布差異及相互關系,厘清流域生態系統中環境過濾作用對捕食線蟲真菌擴散的影響,回答水陸間是否存在擴散限制及其在流域生態系統中的物種多樣性格局形成作用問題。

1 研究方法

1.1 研究區域概況

瀾滄江流域地勢由北向南呈階梯狀下降,主體地貌特征表現為高山峽谷相間,隨山脈南延,山川間距由上游向下逐漸展寬[28]。流域內支流眾多,河流流量大,地勢起伏,河流落差大[29],生物資源十分豐富[30]。本研究基于瀾滄江的兩條支流沘江和黑惠江開展,根據實際地形情況,在研究區域內每間隔50 km設置一個樣點,規避城市等強人為干擾區、高山深谷等不可到達的區域,最終于沘江和黑惠江兩條支流上設置12個采樣點,具體樣點布設如圖1。

圖1 研究區域和采樣點布設Fig.1 The study area and sample points distribution 圖中IT、IR、IX、IY、AA、AB、AC、AD、AF、AH、AJ為采樣點編號,采樣點編號根據空間位置和采樣順序設置

1.2 樣品采集

為了保證采樣點的物候一致和水陸界限分明,于2014年3—4月份進行了樣品采集。采樣點盡量選擇在水流交匯處,以水流匯入點為原點,采集原點上下游各10 m、20 m處對稱水(底泥)、陸(土壤)樣品共10份(圖2),每份樣品按五點采樣法采集0—10 cm深度的混合土樣(或底泥)約50 g置于一次性自封袋中常溫保存,并用油性記號筆標記樣點編號、采樣時間、海拔、經緯度、水或陸等樣品信息,采集好的樣品于一周內帶回實驗室并立即開展捕食線蟲真菌的分離、純化工作。所有樣品采集由中科院昆明動物所專職采樣人員協助完成。

圖2 每個采樣點的采樣示意圖Fig.2 Sampling design of each sample point

1.3 菌株的分離純化

1.3.1培養基的制備

玉米培養基(Cornmal Agar Medium,CMA)、土豆培養基(Potato Dextrose Agar Medium,PDA)以及燕麥培養基均參照文獻[31]配制。

1.3.2誘餌線蟲的培養及線蟲懸浮液的制備

將全齒復活線蟲(Panagrellusredivivus)接入燕麥培養基,放恒溫培養箱(26.5±1)℃培養一周,直到觀察到線蟲爬壁即可取出備用或放4℃冰箱保存。采用貝爾曼氏漏斗法[17]制備線蟲懸浮液。

1.3.3捕食線蟲真菌的分離純化

將土壤樣本0.5—1 g均勻地撒在90 mm的 CMA上(在樣品之間留有空隙),加入線蟲懸液2 mL(約5000條)線蟲以誘導捕食線蟲真菌生長,每份土樣設3個重復。室溫下培養4周,體視顯微鏡下進行鏡檢。

觀察到捕食線蟲真菌孢子后,用無菌牙簽挑取單個真菌孢子到直徑為60 mm的CMA培養基上,用保鮮膜封口,置于(26.5±1)℃恒溫培養箱中培養1周。

1.4 捕食線蟲真菌的鑒定

1.4.1形態學鑒定

采用插片法制作捕食線蟲真菌臨時裝片,用奧林巴斯BX53微分干涉顯微鏡拍取分生孢子、孢子梗、厚垣孢子和捕食器官等形態特征。參照《Nematode-trapping fungi》 和《中國真菌志-三十三卷》進行形態學鑒定。

1.4.2分子生物學鑒定

將分生孢子轉接至60 mm的PDA上進行菌絲富集培養,待菌絲富集后,刮取菌絲,用CTAB法提取菌株的DNA,外送至生物測序公司進行DNA測序。通過ITS(internal transcribed spacer region of the ribosomal RNA gene,核糖體RNA上的非轉錄間隔區)及RPB2(RNA polymerase II core subunit,RNA聚合酶II核心亞基編碼基因)序列同源性比對進行分子生物學鑒定。

1.5 數據分析與處理

(1)計算水、陸及全部樣品中的物種檢出率,計算公式為：

總檢出率(OF)=(檢出捕食線蟲真菌的樣品數/總樣品數)×100%

水檢出率(AOF)=(檢出捕食線蟲真菌的水體底泥數/總水體底泥數)×100%

陸檢出率(TOF)=(檢出捕食線蟲真菌的陸地土壤數/總陸地土壤數)×100%

物種檢出率(SOF)=(檢出某物種的樣品數/總樣品數)×100%

(2)對水、陸及總體捕食線蟲真菌物種多樣性指數進行計算,比較水、陸間物種多樣性差異,物種多樣性指數(Shannon-Wiener index,H′)計算公式為：

式中,H′ 為 物種多樣性指數；Pi為第i個種所占百分數；S為采樣點的物種數

(3)應用Adobe Photoshop 2019繪制沘江和黑惠江研究區域內捕食線蟲真菌的物種分布圖。

(4)應用RStudio1.3.1093中的“VennDiagram”包繪制水陸間物種組成韋恩圖,比較各對稱水、陸采樣位點間的物種組成差異。

(5)應用Execl和SPASS對數據進行整理及分析。

2 結果與分析

2.1 捕食線蟲真菌總檢出情況

本研究共分離到捕食線蟲真菌2屬13種88株,總檢出率為47.5%,多樣性指數為2.07,其中：陸地土壤中共分離到2屬11種45株,檢出率為41.67%,多樣性指數為1.99；水體底泥分離出1屬10種43株,檢出率為53.33%,多樣性指數為1.93。各物種在水、陸的檢出情況詳見圖3。

圖3 捕食線蟲真菌水、陸物種檢出率比較Fig.3 Comparsion of species′ occurrence frequency of nematode-trapping fungi between terrestrial and aquaticA.為Arthrobotrys屬的縮寫,Dac.為Dactylellina屬的縮寫; A. oligospora: 少孢節叢孢; A.conoides: 圓錐節叢孢; A.eudermata: 厚皮單頂孢; A.oudemansii: 秀麗單頂孢; A.longiphora: 長梗單頂孢; A.rutgeriense: 狂帶單頂孢; A.cystosporia: 囊孢單頂孢; Dac. Leptospora: 長孢隔指孢; A.globospora: 球狀單頂孢; A.superba: 強力節叢孢; A.musiformis: 彎孢節叢孢; A.xiangyunensis: 祥云單頂孢; A.thaumasia: 奇妙單頂孢

2.2 各物種水陸采樣點檢出情況

研究區域內分離到的捕食線蟲真菌中,有3個物種在水、陸檢出的樣點數相同,分別為Arthrobotrysoligospora、Arthrobotrysoudemansii和Arthrobotryslongiphora。Arthrobotrysglobospora和Arthrobotryssuperba只在水體底泥中檢出,為研究區域內水體底泥中特有物種；Arthrobotrysrutgeriense、Arthrobotryscystosporia和Dactylellinaleptospora只在陸地土壤中檢出,為研究區域內陸地土壤中特有物種。Arthrobotrysxiangyunensis和Arthrobotrysmusiformis的水體底泥中樣點檢出數較陸地土壤多,Arthrobotrysconoides、Arthrobotrysthaumasia和Arthrobotryseudermata的陸地土壤樣點檢出數較水體底泥中多。各個物種在水、陸12個樣點中檢出的樣點數見表1。

表1 捕食線蟲真菌檢出樣點數Table 1 The number of detected sample points of nematode-trapping fungi

2.3 兩支流各采樣點對稱水陸位點間物種組成差異

研究區域內,黑惠江比沘江擁有更高的物種多樣性(圖4),且兩支流捕食線蟲真菌在對稱水、陸位點間的物種組成均存在較大的差異：

圖4 瀾滄江兩條支流捕食線蟲真菌物種分布 Fig.4 Species distribution of nematode-trapping fungi in two tributaries of the Lancang River

沘江共分離出1屬9種捕食線蟲真菌,其中陸地土壤中分離出1屬8種,水體底泥中分離出1屬6種,水陸間物種組成相似性指數為0.57。而對沘江各樣點對稱水、陸間物種組成分析發現：AJ樣點水、陸間物種組成完全不同,且陸地土壤中物種多樣性高于水體底泥；AG樣點水體底泥中物種是陸地土壤中物種的子集；AH和AF兩樣點的對稱水陸間物種組成存在差異的同時也存在一定的相似性；IT樣點陸地土壤中物種是水體底泥中物種的子集(圖5)。

黑惠江共分離出捕食線蟲真菌2屬13種,其中陸地土壤中分離出2屬10種,水體底泥中分離到1屬9種,水陸間物種組成相似性指數為0.63。其中AA點和IR點分別只在陸地土壤和水體底泥中有物種檢出；AC和AD兩樣點的對稱水陸間物種組成完全不同,且物種豐富度前者陸地土壤大于水體底泥,后者水體底泥大于陸地土壤；IY、IX和AB三個樣點的對稱水陸間物種組成存在差異的同時也存在一定的相似性(圖5)。

圖5 每個采樣點水陸間捕食線蟲真菌物種組成Fig.5 Species composition of nematode-trapping fungi between terrestrial and aquatic of each sample pointT: 陸地土壤 Terrestrial soil; A: 水體底泥 Aquatic sediment;黃色部分為陸地中檢出的物種數,藍色部分為水中檢出的物種數,灰色部分為水陸共有的物種數

3 討論

3.1 瀾滄江支流捕食線蟲真菌分布存在水陸差異

研究結果顯示,捕食線蟲真菌在瀾滄江支流的物種多樣性分布存在水陸差異：首先,研究區域內水體底泥中捕食線蟲真菌物種檢出率高于陸地土壤,而陸地土壤中物種多樣性則略高于水體底泥；其次,在瀾滄江支流分離出的捕食線蟲真菌絕大多數為產黏性菌網的Arthrobotrys屬真菌,占總物種數的92.31%,但這類捕食線蟲真菌在水、陸環境間的物種分布存在一定的差異；第三,捕食線蟲真菌群落結構在瀾滄江兩條支流的水、陸間均存在不同程度的差異。此前有研究者提出,水生生態系統較陸生生態系統有持續的環境梯度和水流均一性[32],水流的均一性使得捕食線蟲真菌在水中更容易被檢出可能是其在水體底泥中檢出率較高的原因,而水陸生境異質性則決定了物種在水、陸間的多樣性分布差異。產黏性菌網的Arthrobotrys屬真菌以營養要求簡單、腐生能力強、生長迅速等特點廣泛分布于各種生態環境中[33—35],但這類捕食線蟲真菌在水、陸環境間的物種分布存在一定的差異,表明捕食線蟲真菌的環境適應能力也存在屬內差異,這與范喜杰等[36]對大理溫泉中捕食線蟲真菌的研究結論一致。此外,在分析沘江和黑惠江各自的物種組成時發現,捕食線蟲真菌在瀾滄江兩條支流間呈現不同的分布模式：兩支流的整體群落結構存在差異；兩支流水、陸間捕食線蟲真菌群落相似性不同,擁有較高物種多樣性的黑惠江水、陸間物種相似性更高；同一個物種在不同的樣點甚至不同的流域會有不同的水、陸分布特點。這表明流域間及流域內的水生和陸生環境間均存在明顯的環境過濾,物種在流域內也同樣存在生境選擇和生境適應性,而捕食線蟲真菌是一個小類群,兩生境中物種多樣性越高,物種重疊的概率可能就越大。

3.2 捕食線蟲真菌水陸分布聯系緊密

微生物在流域內分布存在水陸差異的同時其在水陸間也應該是相互聯系的,而之前的研究把水生和陸生物種相互割裂開分析,僅有少量的研究做了水生和陸生物種多樣性的比較[15—16],但仍缺少水陸關系研究。在對瀾滄江支流各采樣點的對稱水陸樣點間捕食線蟲真菌物種組成差異分析中發現,捕食線蟲真菌在對稱水陸樣點間物種組成存在明顯差異的同時還存在相互聯系。盡管捕食線蟲真菌是一類水、陸廣泛分布的真菌類群,本研究分離得到的物種全部為已知種,且除A.xiangyunensis只在溫泉底泥中報道過以外[18],其余物種均在水、陸生境中報道過[17, 26, 37],但本研究區域內不僅有在水體底泥、陸地土壤中均有檢出的物種,還有只在于水體底泥或陸地土壤中檢出的物種；既有對稱水、陸間群落組成存在較大差異的樣點,也有水、陸間群落組成相似性較高的樣點,表明在流域生態系統內,水、陸生境間存在一定的擴散限制,水流既積極作用于捕食線蟲真菌的擴散,同時也形成地理屏障限制了物種的分布。此前有研究指出,水生微生物可能是由于陸生環境中的微生物因河流漲水后長時間的浸泡與沖刷作用而擴散到水中,然后隨水流擴散至水生或陸生環境[38—39]；長期適應水環境而存在于水生境中的微生物也可能會隨水流擴散至陸生環境,最后因水流減少或者水流滲透作用而停留在河岸帶[40]。在本研究中,這兩種可能性或許都存在,而捕食線蟲真菌各物種的擴散能力、環境適應能力和定植能力的差異導致其在水陸環境的分布呈現一定的差異性,表明流域內水生生態系統可通過水文循環驅動流域內環境及生物相互聯系,并通過徑流和地下水運動與陸地生態系統緊密相連,使得微生物能夠在流域內水、陸間橫向擴散,從而形成在水陸間的空間分布格局。

3.3 陸地可能是流域內捕食線蟲真菌多樣性的源

從整體來看,即便有水流的均一性作用,陸地土壤的檢出樣點數和捕食線蟲真菌物種多樣性仍高于水體底泥,且有Dactylellina屬的檢出。這說明和其他微生物一樣,陸地土壤也是捕食線蟲真菌繁衍的大本營,是其主要的演化場所,因此,陸地土壤可能是捕食線蟲真菌在流域內多樣性的源。在流域生態系統中,微生物物種多樣性分布在水陸間既存在差異又相互聯系,水陸間的擴散限制和水流的連通性均對微生物在流域內的擴散和分布極其重要,是流域內微生物物種多樣性分布格局產生和維持的重要機制。

4 結論

本研究明晰了捕食線蟲真菌在支流流域內水、陸分布差異及其相互關系,發現水、陸不同生境對捕食線蟲真菌空間分布格局塑造的作用是不一致的：陸地是捕食線蟲真菌的主要演化場所,水流是流域內捕食線蟲真菌的重要傳播因子。此前大多數流域生態學的研究沒有充分考慮流域的水陸耦合作用,建議未來在開展微生物的流域分布格局研究時應考慮各級支流微生物的分布差異,同時兼顧水、陸環境異質性及河流對微生物的擴散和阻隔作用。

致謝:中國科學院昆明動物所陳錦輝老師在樣品采集中給予幫助,大理大學創新團隊(ZKLX2019103)給予支持，特此致謝。