二萜化合物土槿乙酸觸發(fā)自噬作用的研究進展

王 丹，韓甜甜，趙明義

(1.遼寧大學(xué) 藥學(xué)院，遼寧 沈陽 110036；2.沈陽市兒童醫(yī)院 輸血科，遼寧 沈陽 110032)

0 引言

自噬(Autophagy)是真核生物對細胞內(nèi)物質(zhì)進行循環(huán)再利用的主要進化機制，是溶酶體對受損蛋白以及細胞器降解的主要形式之一，以維持細胞新陳代謝和機體動態(tài)平衡[1].營養(yǎng)匱乏、缺氧、DNA受損等應(yīng)激刺激均可激發(fā)細胞自噬[2].目前研究表明自噬有3種類型，分別是巨自噬(Macroautophagy)、微自噬(Microautophagy)和分子伴侶介導(dǎo)的自噬(Chaperone-mediated autophagy)[3].巨自噬是自噬方式中最為常見的一種，在真核細胞中普遍存在[2].自噬在維持人類身體健康、防治疾病等方面發(fā)揮著重要作用，并參與機體的多種生理病理過程，與細胞衰老[4]、機體自身免疫性疾病[5]、神經(jīng)退行性疾病[6]以及癌癥[7]等疾病均有密切關(guān)系.

土槿皮為松科植物金錢松Pseudolarixamabilis的干燥根皮或近根樹皮，其性溫、味辛、有毒，歸肺、脾經(jīng).土槿皮具有殺蟲、止癢的功效，清代趙學(xué)敏所著《本草綱目拾遺》已有土槿皮治療皮膚癬癥的記錄，現(xiàn)有外用復(fù)方土槿皮酊用于治療由真菌感染的皮膚病.土槿皮的主要化學(xué)成分土槿乙酸(Pseudolaric acid B，PAB)是從金錢松的根皮或近根樹皮中分離提取的主要成分之一，為一種二萜類酸，分子式為C23H28O8，化學(xué)結(jié)構(gòu)如圖1.該化合物具有抗炎[8]、抗真菌[9]、調(diào)節(jié)免疫[10]、抗腫瘤[11]等作用，具體機制為抑制腫瘤細胞異常增殖、細胞周期阻滯、誘導(dǎo)細胞凋亡及調(diào)節(jié)信號通路等[12]，且PAB還可能通過觸發(fā)細胞自噬的方式發(fā)揮藥理活性.PAB作為一種微管蛋白結(jié)合劑，還可與微管蛋白結(jié)合，破壞細胞骨架穩(wěn)定性，抑制血管生成[13].研究發(fā)現(xiàn)其他二萜化合物如鼠尾草酸(Carnosic acid，CA)、雷公藤甲素(Triptolide，TP)、藍萼甲素(Glaucocalyxin，GL)等也可通過調(diào)控細胞自噬的途徑發(fā)揮功效.本文主要綜述二萜化合物土槿乙酸觸發(fā)細胞自噬的研究進展.

圖1 土槿乙酸的分子結(jié)構(gòu)

1 PAB觸發(fā)細胞自噬的作用

1.1 PAB觸發(fā)小鼠成纖維L929細胞自噬

研究表明，PAB作用于小鼠成纖維L929細胞后以時間和劑量依賴的方式抑制細胞的增殖，上調(diào)自噬相關(guān)蛋白Beclin-1表達，使微管蛋白由LC3-Ⅰ轉(zhuǎn)化為LC3-Ⅱ，提示PAB通過細胞自噬的方式抑制細胞增殖[14].且PAB通過激活蛋白激酶C(PKC)活性，誘導(dǎo)細胞周期阻滯、促進活性氧(ROS)生成、誘導(dǎo)線粒體功能障礙等觸發(fā)細胞自噬，引起衰老[15-16].另有研究證明[17]PAB通過觸發(fā)ROS-JNK-p53通路，抑制mTOR活性，進而抑制由Akt-mTOR途徑引發(fā)的L929細胞自噬，減緩衰老.

1.2 PAB觸發(fā)人甲狀腺鱗狀癌細胞SW579自噬

PAB作為一種抗微管蛋白藥物，可以通過干擾α-微管蛋白聚合，以時間和劑量依賴的方式抑制人甲狀腺鱗狀癌細胞SW579的生長.PAB可導(dǎo)致微管纖維聚集，使細胞形態(tài)受損，并有效抑制細胞遷移.PAB可將細胞周期阻滯于G2/M期.單丹磺酰尸胺(MDC)染色實驗發(fā)現(xiàn)黃綠色熒光增加，提示自噬標志物增加.自噬抑制劑3-MA處理細胞后，細胞自噬被抑制，細胞存活率降低，說明PAB可通過觸發(fā)細胞自噬抑制SW579細胞生長.因此PAB可作為治療原發(fā)性甲狀腺鱗狀細胞癌的候選藥物[18].

1.3 PAB觸發(fā)人肺成纖維細胞MRC5自噬

在對小鼠成纖維細胞L929和人甲狀腺鱗狀癌細胞SW579的研究發(fā)現(xiàn)，PAB僅誘導(dǎo)細胞發(fā)生自噬，不誘導(dǎo)L929和SW579細胞凋亡.在研究PAB對人肺成纖維細胞MRC5的影響時，得出了同樣的結(jié)論.PAB處理MRC5細胞后，觀察細胞形態(tài)未見凋亡小體或細胞核凝聚，在DNA梯形實驗中，發(fā)現(xiàn)PAB作用36 h后未見DNA梯帶，由此得出結(jié)論PAB不誘導(dǎo)MRC5細胞發(fā)生凋亡.另外用4 μmol/L PAB處理MRC5細胞，MDC染色后發(fā)現(xiàn)自噬標志物增加.應(yīng)用Western-Blot方法檢測自噬相關(guān)蛋白Beclin-1和LC3的表達情況，研究發(fā)現(xiàn)Beclin-1蛋白表達增加，LC3-Ⅰ轉(zhuǎn)化為LC3-Ⅱ，以上結(jié)果表明PAB誘導(dǎo)MRC5細胞發(fā)生自噬現(xiàn)象效果顯著.當與自噬抑制劑3-MA聯(lián)合使用后，研究者發(fā)現(xiàn)PAB通過上調(diào)p-JNK、caspase-3及下調(diào)p-ERK蛋白表達誘導(dǎo)細胞凋亡，且在此過程中對PAB的微管聚集能力無顯著影響.這可能為PAB在抗腫瘤治療研究方面提供了一種新策略[19].

1.4 PAB觸發(fā)人乳腺癌細胞MCF-7自噬

已發(fā)表的文獻證明，PAB對人乳腺癌細胞MCF-7細胞具有細胞毒性[20].但并不是所有的細胞都在PAB處理后死亡，而是有一部分細胞經(jīng)3 d PAB處理后仍然存活.且PAB以時間和劑量依賴的方式誘導(dǎo)MCF-7細胞凋亡及觸發(fā)其自噬發(fā)生.研究者采用4 μmol/L PAB處理36 h，自噬體染料MDC染色顯示自噬標記物增加.Western-Blot實驗結(jié)果表明經(jīng)PAB處理后，MCF-7細胞中自噬相關(guān)蛋白Beclin-1和LC3-Ⅱ的表達增加[21].與單獨使用PAB相比，PAB與自噬抑制劑3-MA聯(lián)合使用后，細胞自噬率降低，凋亡率升高，提示自噬促進細胞存活.這也許就是經(jīng)PAB處理后仍有一部分細胞存活的原因.PAB處理細胞后，線粒體膜電位無影響，Bcl-2表達增加.此外PAB抑制Bcl-2與Beclin-1結(jié)合，從而釋放Beclin-1參與自噬.因此，在PAB對人乳腺癌細胞MCF-7的作用中，會同時觸發(fā)細胞自噬和誘導(dǎo)細胞凋亡.提示，在臨床應(yīng)用PAB治療乳腺癌疾病時，聯(lián)合使用PAB和自噬抑制劑可能會提高治療效果.

1.5 PAB觸發(fā)前列腺癌細胞PC-3自噬

PAB通過激活JNK通路誘導(dǎo)前列腺癌PC-3細胞周期阻滯于G2/M期以及誘導(dǎo)細胞凋亡.Western-Blot實驗結(jié)果表明PAB作用PC-3細胞后Beclin-1和LC3-Ⅱ蛋白表達上調(diào)，而p-Akt、p-mTOR等蛋白表達降低，提示PAB可抑制Akt-mTOR通路，觸發(fā)PC-3細胞自噬.此外，PAB還通過激活JNK通路而使前列腺癌細胞對Bcl-2抑制劑(ABT-737)增敏，抵抗其產(chǎn)生的細胞毒副作用.另外研究者采用雄激素依賴性前列腺癌細胞株LNCaP檢測PAB的抗前列腺癌活性，發(fā)現(xiàn)PAB對LNCaP有劑量依賴性的抑制作用.證明PAB對雄激素依賴性和非依賴性前列腺癌細胞均有較強的抑制增殖作用[22].此外，最近一項研究表明，PAB可通過降解Bcl-2，誘導(dǎo)激素非依賴性前列腺癌細胞DU145凋亡[23].這使PAB有望成為一種有潛力的治療前列腺癌的候選藥物.

1.6 PAB觸發(fā)人肺癌細胞A146自噬

盧政霞等[24]利用四甲基偶氮唑藍(MTT)分析法、MDC熒光染色法、流式細胞儀分析法等考察了PAB對人肺癌細胞A146的影響，研究發(fā)現(xiàn)PAB作用于A146細胞后，細胞數(shù)目明顯減少；MDC熒光染色呈亮綠色，提示自噬標志物增加；流式細胞儀結(jié)果顯示，加入PAB后，MDC陽性率增加，Western-Blot實驗結(jié)果顯示PAB激發(fā)自噬相關(guān)蛋白Beclin-1表達，伴隨LC3轉(zhuǎn)型.由此得出PAB可誘發(fā)A146細胞產(chǎn)生細胞自噬，且自噬在抑制A146細胞生長增殖中發(fā)揮了關(guān)鍵作用.

1.7 PAB觸發(fā)人卵巢癌細胞HO-8910自噬

王佳賀等[25]通過探討PAB對人卵巢癌細胞HO-8910自噬的作用機制，發(fā)現(xiàn)PAB作用于HO-8910后，細胞存活率顯著降低，Western-Blot實驗結(jié)果表明Beclin-1和LC3-Ⅱ的表達增加，而p-Akt、p-mTOR等蛋白表達下調(diào)，另外加入3-甲基腺嘌呤(3-MA)和雷帕霉素(RAPA)后，發(fā)現(xiàn)3-MA對自噬相關(guān)蛋白起抑制作用，而RAPA促進自噬相關(guān)蛋白的表達.得出PAB可通過抑制PI3K/Akt/mTOR通路誘導(dǎo)卵巢癌細胞HO-8910引發(fā)自噬.

2 PAB觸發(fā)細胞自噬的可能的分子機制

根據(jù)上述的PAB觸發(fā)多種細胞發(fā)生自噬情況，其具體的作用機制主要為以下3種，分別是PI3K/Akt/mTOR信號通路、JNK信號通路、Beclin-1信號通路.

2.1 PI3K/Akt/mTOR通路

PI3K/Akt/mTOR通路是較為重要的一條信號通路，在細胞凋亡、細胞增殖中均起著關(guān)鍵作用，該通路也參與Tau蛋白的調(diào)節(jié).mTOR是一種經(jīng)典的自噬調(diào)節(jié)因子，在自噬中起到了樞紐作用.對早期阿爾茨海默病(AD)患者研究發(fā)現(xiàn)，該信號通路處于激動狀態(tài)[26].因此可通過抑制該通路，增強自噬-溶酶體功能，減輕AD癥狀[27].大量研究表明PAB可通過抑制該信號通路，激發(fā)細胞自噬，發(fā)揮藥理活性.王佳賀等[25]通過探討PAB對卵巢癌細胞HO-8910自噬的作用機制，發(fā)現(xiàn)PAB可通過抑制PI3K/Akt/mTOR通路誘導(dǎo)卵巢癌細胞HO-8910引發(fā)自噬.Qi等[17]同樣發(fā)現(xiàn)PAB可通過抑制Akt-mTOR通路激發(fā)L929細胞自噬，起到減緩衰老的效果.Jing等[22]探究PAB對PC-3作用時，發(fā)現(xiàn)PAB通過抑制Akt-mTOR通路，激活PC-3細胞自噬.

2.2 JNK通路

JNK是促分裂素原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPK)家族的成員之一，研究顯示JNK通路與mTOR存在密切聯(lián)系.有研究發(fā)現(xiàn)PAB可通過觸發(fā)ROS-JNK-p53通路，抑制mTOR活性[17]；PAB也可激活JNK通路而使前列腺癌細胞對ABT-737增敏，從而釋放Beclin-1參與自噬[22].

2.3 Beclin-1信號通路

Beclin-1蛋白作為一種自噬相關(guān)蛋白，通常可與人Ⅲ型磷酸肌醇-3-激酶(human type Ⅲ phosphatidylinositol 3-kinase，hVps34)、自噬相關(guān)蛋白Atg14及p150形成PI3KC3復(fù)合物，然而，抗凋亡蛋白Bcl-2可與Beclin-1結(jié)合進而抑制由Beclin-1蛋白介導(dǎo)的細胞自噬.在氧氣匱乏、饑餓等特殊情況下，Bcl-2發(fā)生磷酸化，并從該復(fù)合物中解離，釋放Beclin-1蛋白從而誘導(dǎo)自噬[28].研究表明PAB可激活Beclin-1蛋白表達上調(diào)，觸發(fā)自噬發(fā)生[24].

3 展望

本文主要綜述了二萜化合物PAB可觸發(fā)多種細胞自噬發(fā)生及其可能的分子機制.世界衛(wèi)生組織發(fā)布的最新數(shù)據(jù)顯示，AD已成為全球十大死亡原因之一.AD的發(fā)病機制與大腦中β淀粉樣蛋白異常積累沉積[29]、Tau蛋白過度磷酸化[30]、腦組織內(nèi)細胞因子水平較高表達、炎癥基因表達上調(diào)[31]有關(guān).研究表明在治療AD中多采用自噬-溶酶體途徑降解異常蛋白.細胞自噬可有效清除異常蛋白，也可通過調(diào)節(jié)細胞因子分泌參與炎性反應(yīng)[32].

其他二萜化合物如CA、TP、GL等也可通過調(diào)節(jié)細胞信號通路的方式調(diào)控細胞自噬，清除異常蛋白，發(fā)揮抗AD活性.CA可通過調(diào)節(jié)細胞自噬的方式發(fā)揮其在治療神經(jīng)退行性疾病中的作用[33].實驗證明，在由Aβ25-35誘導(dǎo)的AD模型中，CA可顯著降低細胞死亡，提高細胞存活率，且呈現(xiàn)劑量時間依賴性誘導(dǎo)細胞發(fā)生自噬，對由Aβ25-35引起的神經(jīng)元損傷起保護作用[34].TP作為一類高效的自噬誘導(dǎo)劑，通過自噬途徑可有效清除各種類型的α-突觸核蛋白，避免沉積[35].藍萼甲素A(Glaucocalyxin A，GLA)以及藍萼甲素B(Glaucocalyxin B，GLB)在治療神經(jīng)退行性疾病中發(fā)揮著重要作用[36].GLA可以作為mTOR抑制劑，通過抑制Akt/mTOR自噬信號通路機制，提高腦組織內(nèi)淀粉樣β蛋白的清除率，同時通過抑制mTOR/p70S6K通路，抑制Tau蛋白磷酸化[37].對治療AD具有巨大潛力.GLB預(yù)處理可誘導(dǎo)Akt/mTOR信號通路激活，從而對糖氧剝奪模型(OGD/R)誘導(dǎo)的PC12細胞損傷有明顯的保護作用[38].

PAB作為一種二萜化合物亦可通過調(diào)節(jié)PI3K/Akt/mTOR信號通路、JNK信號通路、Beclin-1信號通路等觸發(fā)細胞自噬發(fā)生，發(fā)揮其延緩衰老以及抗腫瘤功效.

綜上所述，研究者推測微管蛋白結(jié)合劑PAB可能在通過觸發(fā)細胞自噬治療AD方面具有一定潛力.目前關(guān)于PAB方面研究主要集中于抗腫瘤活性，關(guān)于抗AD活性方面研究未見報道.因此，進一步研究其抗AD方面活性，有助于發(fā)現(xiàn)更多抗AD藥物，為抗AD藥物篩選提供更多理論依據(jù).