miR-299-3p靶向ALDH3A1下調NF-κB信號通路誘導胃癌細胞凋亡的機制研究

周寧 于文燕

胃癌(gastric cancer)是一種常見的惡性消化系統腫瘤，病死率高居世界癌癥第二位[1]，2018年估計有78.3萬人死于胃癌，50%的患者來自中國，歐洲國家胃癌5年生存率為10%～30%[2]。研究胃癌進展的潛在機制，為疾病診治提供有效分子靶點，已成為胃癌基礎臨床研究的重點。miRNA(micro RNA)在胃癌組織和體液中表達異常，對胃癌診斷和預后具有重要應用前景[3]。另有研究表明，miR-299-3p在舌鱗狀細胞癌[4]、肝癌[5]中都發揮抑癌作用，miR-299-3p在胃癌組織中低表達，可能參與胃癌的發生發展[6]。乙醛脫氫酶3A1(aldehyde dehydrogenase 3A1，ALDH3A1)在胃癌細胞中高表達，高表達ALDH3A1的胃癌患者生存期顯著縮短[7,8]。下調ALDH3A1會抑制NF-κB的轉錄，進而抑制肺癌細胞的增殖[9]。miR-299-3p和ALDH3A1在胃癌中是否存在關系也有待研究。本研究旨在探尋miR-299-3p對胃癌凋亡的影響，并分析其作用機制是否與調控ALDH3A1有關。

1 材料與方法

1.1 材料 人胃癌細胞株BGC-823、SGC-7901、MKN-45和正常胃上皮細胞GES-1購自ATCC；胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)(10099141)和RPMI-1640培養基(C22400500BT)購自美國Gibco公司，牛血清白蛋白(Bovine Serun Albumin,BSA)(A3912)、四氮唑藍(MTT)(M2128)、二甲基亞砜(DMSO)(D2650)和胰蛋白酶Trypsin(T7409)購自美國Sigma-Aldrich公司；引物、miR-299-3p模擬物(miR-299-3p)、抑制劑(anti-miR-299-3p)、ALDH3A1的過表達載體(pcDNA- ALDH3A1)、干擾物(si-ALDH3A1)、陰性對照(miR-con、anti-miR-con和si-con)、雙熒光素酶載體、空載體pcDNA購自上海吉瑪制藥有限公司；雙熒光素酶報告系統購自美國Promega公司；Bax抗體(ab32503)、Bcl2抗體(ab59348)、NF-κB抗體(ab28849)、ALDH3A1抗體(ab76976)和β-actin抗體(ab179467)購自英國Abcam公司；IκB-α抗體(9242s)、p-IκB-α抗體(2859s)抗體購于美國CST公司；RNA提取試劑TRIzol(10296010)、Lipofectamine 2000轉染試劑(13778-075)、反轉錄試劑、real-time PCR 試劑盒購自美國Invitrogen公司；細胞凋亡檢測試劑盒購自美國BD公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養:將人胃癌細胞株SGC-7901、MKN-45、BGC-823和正常胃上皮細胞GES-1培養在含10% FBS、100 U/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素的RPMI-1640培養液中，于濕度95%， 5% CO237℃培養箱中培養。

1.2.2 細胞轉染:收集90%融合細胞，Trypsin消化，稀釋細胞至濃度1×106個/ml，在6孔板培養。無血清OptiMEM培養液分別稀釋Lipofectamine 2000和不同載體，將上述混合物輕柔混勻，室溫作用20 min，加入融合為60%細胞，培養6 h，更換RPMI-1640完全培養基，收集轉染48 h細胞進行后續實驗。

1.2.3 qRT-PCR檢測RNA的表達:用TRIzol試劑從胃癌細胞、胃正常上皮細胞中提取總RNA，采用反轉錄試劑盒合成cDNA，按照real-time PCR的說明書以cDNA為模板進行熒光定量PCR。用2-ΔΔCt方法分析miR-299-3p和ALDH3A1 mRNA表達量。

1.2.4 Western blot實驗:RIPA法提取各實驗組胃癌細胞總蛋白。取適量變性蛋白樣品進行SDS-PAGE，轉膜后，脫脂奶粉室溫封閉2 h，洗膜3次，加入稀釋的ALDH3A1抗體(1∶1 200)、Bax抗體(1∶2 000)、Bcl2抗體(1∶1 500)、IκB-α抗體(1∶1 500)、NF-κB抗體(1∶1 000)、p-IκB-α抗體(1∶1 000)和β-actin抗體(1∶2 000)4℃過夜孵育，洗膜3次，然后用酶標二抗室溫孵育2 h。顯影后，以β-actin為內參照，Image-Pro Plus 6.0軟件分析目的蛋白表達量。

1.2.5 流式細胞術檢測細胞凋亡:將轉染后各組SGC-7901細胞消化并用結合緩沖液稀釋為1×106個/ml細胞懸液。取5 μl膜聯蛋白V-FITC(Annexin V-FITC)、5μl PI(碘化丙啶)加入200 μl細胞懸液中混勻，避光反應15 min，流式細胞儀分析細胞凋亡百分比。

1.2.6 雙熒光素酶報告系統實驗:對數期SGC-7901細胞以2×104個/孔接種于24孔板中，培養至細胞60%融和進行轉染，將構建的野生型(WT)和突變型(MUT)熒光素酶報告質粒WT-ALDH3A1、MUT-ALDH3A1分別與miR-con、miR-299-3p mimics、anti-miR-con或anti-miR-299-3p共轉染。培養48 h，RIPA法裂解細胞收集上清，加入底物，發光儀測定熒光素酶活性，計算相對螢火蟲熒光素酶活性。

2 結果

2.1 miR-299-3p和ALDH3A1在胃癌細胞株和胃正常上皮細胞中的表達 Western blot和qRT-PCR結果表明，胃癌細胞株SGC-7901、MKN-45和BGC-823中miR-299-3p表達量與胃正常上皮細胞GES-1相比顯著降低(P<0.05)，ALDH3A1的mRNA和蛋白表達量與胃正常上皮細胞GES-1相比顯著升高(P<0.05)。見圖1，表1。

圖1 檢測胃癌細胞株和胃正常上皮細胞中ALDH3A1的表達

表1 ALDH3A1和miR-299-3p在胃癌細胞株中的表達

2.2 過表達miR-299-3p可誘導胃癌細胞SGC-7901凋亡 miR-299-3p組SGC-7901細胞的miR-299-3p表達量、凋亡率、Bax蛋白表達量與miR-con組相比顯著升高(P<0.05)，Bcl2蛋白表達量與miR-con組相比顯著降低(P<0.05)。見表2，圖2、3。

表2 過表達miR-299-3p對胃癌SGC-7901細胞凋亡的影響

圖2 過表達miR-299-3p對胃癌SGC-7901細胞凋亡的影響

圖3 western blot檢測過表達miR-299-3p對SGC-7901細胞凋亡相關蛋白的影響

2.3 miR-299-3p靶向調控ALDH3A1的表達 Targetscan預測到miR-299-3p與ALDH3A1的3’-UTR存在特異結合位點。與轉染miR-con相比，轉染miR-299-3p mimics后SGC-7901細胞WT-ALDH3A1的相對螢火蟲熒光素酶活性顯著下降(P<0.05)，而MUT-ALDH3A1的相對螢火蟲熒光素酶相對活性沒有明顯變化；與轉染anti-miR-con相比，轉染anti-miR-299-3p后SGC-7901細胞WT-ALDH3A1的相對螢火蟲熒光素酶活性顯著升高(P<0.05)，而MUT-ALDH3A1的相對螢火蟲熒光素酶活性 沒有明顯變化。Western blot結果發現，miR-299-3p組的ALDH3A1蛋白表達量與miR-con組相比顯著下降(P<0.05)；anti-miR-299-3p組的ALDH3A1表達量與anti-miR-con組相比顯著上升(P<0.05)。見圖4、5，表3、4。

圖4 ALDH3A1的3’-UTR的序列中含有與miR-299-3p互補的核苷酸序列

圖5 miR-299-3p的表達對SGC-7901細胞中ALDH3A1蛋白表達的影響

表3 雙熒光素酶報告實驗

表4 miR-299-3p調控ALDH3A1的表達

2.4 抑制ALDH3A1表達可誘導SGC-7901細胞凋亡 Western blot結果顯示，與si-con組相比，si-ALDH3A1組的ALDH3A1表達量顯著降低(P<0.05)，細胞凋亡率顯著升高(P<0.05)，促凋亡蛋白Bax表達量升高(P<0.05)，抗凋亡蛋白Bcl2表達量顯著降低(P<0.05)。說明抑制ALDH3A1可誘導SGC-7901細胞凋亡。見圖6，表5。

圖6 抑制ALDH3A1表達對SGC-7901細胞中凋亡相關蛋白表達量的影響

表5 抑制ALDH3A1表達對SGC-7901細胞凋亡的影響

2.5 miR-299-3p靶向ALDH3A1調控SGC-7901細胞的NF-κB信號通路和凋亡 與miR-con組相比，miR-299-3p組的NF-κB信號通路蛋白IκB-α表達量無顯著變化，ALDH3A1、p-IκB-α和NF-κB蛋白表達量顯著下降(P<0.05)，細胞凋亡率顯著上升(P<0.05)，Bax表達升高(P<0.05)，Bcl2表達下降；同時過表達miR-299-3p和ALDH3A1則結果相反。見圖7、8，表6、7。

圖7 SGC-7901細胞中NF-κB信號通路相關蛋白的表達

圖8 檢測SGC-7901細胞中凋亡相關蛋白的表達

表6 過表達ALDH3A1逆轉了上調miR-299-3p表達對SGC-7901細胞中NF-κB信號通路相關蛋白表達的影響

表7 過表達ALDH3A1逆轉了上調miR-299-3p表達對SGC-7901細胞凋亡的作用

3 討論

胃癌在中國發病率相對較高，雖然早期患者5年生存率可達90%，但是因早期診斷率低，大多患者確診時已是晚期，預后一般較差，全球晚期5年生存率大約5%～10%，患者生存質量較差，負擔較重[10,11]。研究胃癌細胞凋亡機制可以為疾病提供早期分子治療靶點。

研究表明，在胃癌中，多種miRNA異常表達并通過靶向下游基因，通過多個信號通路影響癌細胞的增殖、轉移、凋亡和耐藥性等過程[12]。G?hring等[13]通過微流體芯片實驗證明，在乳腺癌和纖維肉瘤細胞中，miR-299-3p下調Oct4(Octamer-binding factor)可導致侵襲性降低，miR-299-3p可導致癌細胞凋亡。miR-299-5p在腸型胃腺癌組織中表達顯著下調，可能作為腸型胃腺癌的腫瘤標志物[14]。miR-299-3p在胃癌中表達下調，具體作用機制尚不清楚[6]。本研究發現，miR-299-3p在胃癌細胞株SGC-7901、MKN-45和BGC-823中表達下調，過表達miR-299-3p可以抑制NF-κB信號通路，從而誘導SGC-7901細胞凋亡，證實了miR-299-3p在腫瘤組織多表達下調，并調控癌細胞的凋亡。

ALDH3A1又稱乙醛脫氫酶3A1，是主要存在于哺乳動物角膜中的水溶性蛋白，參與細胞周期調控，保護細胞免受氧化應激[15]。Okazaki等[16]研究發現，ALDH3A1在頭頸部鱗狀細胞癌(HNSCC)細胞高表達，ALDH3A1的下調可增強腫瘤細胞對腫瘤抑制藥物磺胺嘧啶的敏感性。Wu等[17]研究表明，ALDH3A1在胃癌干細胞樣細胞中表達上調，與胃癌的發育不良、分級、分化、淋巴結轉移、腫瘤分期均有較好的相關性。本研究結果發現，ALDH3A1在3個胃癌細胞株中表達上調，抑制ALDH3A1表達可誘導SGC-7901細胞凋亡，證實了ALDH3A1的表達在腫瘤中具有重要意義。

核轉錄因子κB(nuclear factor Kappa B,NF-κB)與胃癌的發病和發展都有關，激活NF-κB信號通路可使促凋亡蛋白Bax、p-IκB-α和NF-κB的過表達，促進細胞凋亡，下調NF-κB信號通路可促進腫瘤細胞的凋亡，抑制腫瘤發生發展[18]。本研究通過檢測NF-κB信號通路蛋白，發現過表達miR-299-3p可抑制NF-κB信號通路，促進癌細胞凋亡，說明miR-299-3p可能通過調控NF-κB信號通路促進癌細胞凋亡。

另外，Targetscan預測到miR-299-3p與ALDH3A1的3’-UTR存在互補的核苷酸序列，提示ALDH3A1是miR-299-3p潛在下游靶點。進一步雙熒光素酶報告實驗證實miR-299-3p靶向負調控ALDH3A1的表達；蛋白表達水平和凋亡實驗表明，過表達ALDH3A1逆轉了上調miR-299-3p對SGC-7901細胞凋亡的促進作用以及對NF-κB信號通路的抑制作用，進一步證實了miR-299-3p與ALDH3A1在胃癌中的調控關系。

本研究首次闡述了在胃癌SGC-7901細胞中miR-299-3p靶向ALDH3A1抑制NF-κB信號通路調控腫瘤細胞的凋亡。這為胃癌發病機制研究提供了新的方向，為防治胃癌的提供了潛在有效靶點。