miR-519a-3p通過靶向GALNT4基因調控肺癌細胞遷移、侵襲和凋亡的分子機制

梁青松 賈軍 胡欣

肺癌臨床治療效果不佳，易復發和轉移[1]。肺癌細胞遷移和侵襲是肺癌復發和轉移的主要原因[2]，探討影響其遷移和侵襲的分子機制對預后改善具有重要意義。miR-519a是一種微小RNA(miRNA)，有報道稱其在非小細胞肺癌組織中表達降低[3]，然而，其對肺癌細胞惡性表型的影響及機制還未知。Starbase生物信息學軟件預測顯示，多肽-N-乙酰氨基半乳糖轉移酶4(GALNT4)可能是miR-519a-3p的靶基因。GALNT4是N-乙酰氨基半乳糖轉移酶的多肽家族成員，是催化O-聚糖合成的關鍵酶。研究顯示，GALNT4在前列腺癌[4]、結腸癌[5]等腫瘤細胞中表達升高，促進腫瘤細胞的惡性表達，發揮促癌基因作用。本研究以miR-519a-3p/GALNT4軸為切入點，探討影響肺癌發生發展的分子機制，以期為肺癌治療提供新靶點。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 正常肺上皮細胞BEAS-2B及肺癌細胞系NCI-H1299、NCI-H2170和PNCI-H1975，中國科學院上海細胞庫；胎牛血清(FBS)，美國Hycolne公司；RPMI 1640培養基、Annexin V-FITC/PI細胞凋亡試劑盒、二喹啉甲酸(BCA)蛋白檢測試劑盒及雙熒光素酶活性檢測試劑盒，北京索萊寶；LipofectamineTM 2000試劑盒，美國Invitrogen公司；RNA抽提試劑盒、逆轉錄試劑盒和PCR試劑盒，大連寶生物；GALNT4抗體，上海鈺博生物科技有限公司；兔抗人基質金屬蛋白酶2(MMP-2)、基質金屬蛋白酶9(MMP-9)和活化的半胱天冬酶-3(Cleaved-caspase-3)單克隆抗體，美國Santa Cruz公司；兔抗人磷脂酞肌醇3-激酶(PI3K)和蛋白激酶B(AKT)磷酸化PI3K(p-PI3K)、磷酸化AKT(p-AKT)單克隆抗體，北京中杉金橋生物試劑公司；PCR引物、miR-519a-3p mimcs、miR-NC、si-GALNT4、si-NC、anti-miR-519a-3p及anti-miR-NC、pcDNA-GALNT4及pcDNA，上海吉瑪制藥技術有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養:復蘇正常肺上皮細胞BEAS-2B及肺癌細胞系NCI-H1299、NCI-H2170和PNCI-H1975，均用含10% FBS的RPMI 1640培養基培養。細胞融合至80%左右時，0.25%胰蛋白酶消化，以1∶3比例傳代培養。將對數期BEAS-2B、NCI-H1299、NCI-H2170和PNCI-H1975細胞均接種于6孔板中(1.0×105個/孔)，培養24 h后，收集細胞，RT-qPCR檢測細胞中miR-519a-3p和GALNT4 mRNA表達。

1.2.2 細胞分組轉染:將對數期NCI-H1299細胞接種于6孔板中(1.0×105個/孔)，利用Lipofectamine 2000試劑盒，分別轉染miR-519a-3p mimcs(miR-519a-3p組)、miR-NC(miR-NC組)、anti-miR-519a-3p(anti-miR-519a-3p組)、anti-miR-NC(anti-miR-NC組)、si-GALNT4(si-GALNT4組)、si-NC(si-NC組)、共轉染miR-519a-3p mimcs及pcDNA-GALNT4(miR-519a-3p+pcDNA-GALNT4組)、miR-519a-3p mimcs與pcDNA(miR-519a-3p+pcDNA組)。RT-qPCR法檢測細胞中miR-519a-3p表達或Western Blot法檢測GALNT4表達驗證轉染效果。

1.2.3 RT-qPCR檢測細胞中miR-519a-3p和GALNT4 mRNA表達:利用RNA抽提試劑盒提取細胞中總RNA，經逆轉錄后，行PCR擴增。反應條件：95℃5 min；95℃ 15 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，共35個循環。引物序列：miR-519a-3p正向5’-GTCCGATAGGTGGCT

AGT-3’，反向5’-CGTAGAGCTGAAGTAAGGCTGAC-3’；U6正向5’-GTAGCGGAGGCTAGGCGAGGAG-3’，反向5’-CGCTCGACATAGACAGGCGACGGC-3’；GALNT4正向5’-TGCTCCGTACCATTCACAGT-3’，反向5’-TCC

AGGAAAGTGAGGACGTC-3’；β-actin正向5’-CTAYY

GGCAACGAGCGGTTC-3’，反向5’-CTTAGGAGTGGGG

GTGGCTT-3’。2-△△Ct法計算miR-519a-3p相對于U6、GALNT4 mRNA相對于β-actin的表達量。

1.2.4 Western Blot法檢測細胞中蛋白表達:各組轉染后的細胞接種于6孔板中(1.0×105個/孔)，培養24 h后，用RIPA試劑提取細胞中總蛋白。經BCA法定量、SDS-PAGE電泳、轉膜和封閉后，分別用GALNT4(1∶1 000)、MMP-2(1∶800)、MMP-9(1∶800)、Cleaved-caspase-3(1∶1 000)、p-PI3K(1∶2 000)、p-AKT(1∶2 000)、β-actin(1∶1 000)一抗孵育液4℃孵育過夜。洗膜后，再用山羊抗兔二抗(1∶5 000)37℃孵育1 h。加化學發光試劑避光顯影，曝光拍照，Image J軟件分析目的蛋白相對于β-actin的表達量。

1.2.5 Transwell檢測細胞遷移和侵襲:將各組轉染后的細胞密度調整為5×104個/ml。遷移實驗：Transwell上室加100 μl細胞懸液，下室加500 μl培養基，培養24 h后，棄培養基。經多聚甲醛固定、結晶紫染色后，顯微鏡觀察。隨機取5個視野，計數。侵襲實驗：在Transwell上室鋪Matrigel基質膠，自然晾干后，再加100 μl細胞懸液，剩余實驗步驟同遷移實驗。

1.2.6 流式細胞儀檢測細胞凋亡:各組轉染后的細胞接種于24孔板中(1.0×104個/孔)，培養24 h后，收集細胞。利用Annexin V-FITC試劑盒，上流式細胞儀檢測細胞凋亡。

1.2.7 miR-519a-3p與GALNT4靶向關系驗證:PCR擴增含miR-519a-3p結合位點的GALNT4的3’UTR序列，克隆至pMIR-Rport質粒，構建GALNT4野生型質粒(WT-GALNT4)。同時，將結合位點利用基因突變技術進行突變，克隆至pMIR-Rport質粒，構建GALNT4突變型質粒(MUT-GALNT4)。將對數期NCI-H1299細胞接種于6孔板中(1.0×105個/孔)，分別共轉染WT-GALNT4與miR-519a-3p mimic、WT-GALNT4與miR-NC、MUT-GALNT4與miR-519a-3p mimic、MUT-GALNT4與miR-NC。6 h后更換培養基。再培養24 h，收集細胞并裂解。離心(3500 r/min，5 min)，取上清液檢測熒光素酶活性，結果以螢火蟲熒光強度與海腎熒光強度的比值表示。同時將miR-519a-3p組、miR-NC組、anti-miR-519a-3p組、和anti-miR-NC組細胞接種于24孔板中(1.0×104個/孔)，24 h后Western Blot法檢測GALNT4蛋白表達，方法同1.2.4。

2 結果

2.1 miR-519a-3p和GALNT4在肺癌細胞系中的表達 肺癌細胞系NCI-H1299、NCI-H2170和PNCI-H1975中miR-519a-3p的表達均低于正常肺上皮細胞BEAS-2B(P<0.05)，而GALNT4 mRNA和蛋白的表達高于BEAS-2B細胞(P<0.05)。由于NCI-H1299細胞中miR-519a-3p和GALNT4表達與BEAS-2B細胞比較差異最顯著，因此選擇NCI-H1299細胞進行后續研究。見圖1,表1。

圖1 Western blot檢測肺癌細胞系中GALNT4蛋白表達

表1 miR-519a-3p和GALNT4在肺癌細胞系中的表達

2.2 高表達miR-519a-3p對肺癌細胞NCI-H1299遷移、侵襲和凋亡的影響 miR-519a-3p組NCI-H1299細胞中miR-519a-3p表達高于miR-NC組(P<0.05)，說明高表達miR-519a-3p的肺癌細胞NCI-H1299構建成功；miR-519a-3p組NCI-H1299細胞遷移和侵襲數、細胞中MMP-2和MMP-9蛋白表達均低于miR-NC組(P<0.05)，而凋亡率、Cleaved-caspase-3蛋白表達高于miR-NC組(P<0.05)，說明高表達miR-519a-3p可阻礙肺癌細胞NCI-H1299遷移和侵襲，而促進其凋亡。見圖2，表2。

圖2 高表達miR-519a-3p對NCI-H1299細胞遷移、侵襲和凋亡的影響；A Transwell檢測高表達miR-519a-3p后NCI-H1299細胞遷移和侵襲(結晶紫染色×200)；B 流式細胞儀檢測高表達miR-519a-3p后NCI-H1299細胞凋亡；C Western blot檢測高表達miR-519a-3p后NCI-H1299細胞中MMP-2、MMP-9、Cleaved-caspase-3蛋白表達

表2 高表達miR-519a-3p對NCI-H1299細胞遷移、侵襲和凋亡的影響

2.3 低表達GALNT4對肺癌細胞NCI-H1299遷移、侵襲和凋亡的影響 si-GALNT4組NCI-H1299細胞中GALNT4蛋白表達低于si-NC組(P<0.05)，說明低表達GALNT4的肺癌細胞NCI-H1299模型構建成功；si-GALNT4組NCI-H1299細胞遷移和侵襲數、細胞中MMP-2和MMP-9蛋白表達均低于si-NC組(P<0.05)，而凋亡率、Cleaved-caspase-3蛋白表達高于si-NC組(P<0.05)，說明低表達GALNT4可阻礙肺癌細胞NCI-H1299遷移和侵襲，而促進其凋亡。見圖3，表3。

圖3 低表達GALNT4對肺癌細胞NCI-H1299遷移、侵襲和凋亡的影響;A Transwell檢測低表達GALNT4后NCI-H1299細胞遷移和侵襲(結晶紫染色×200)；B 流式細胞儀檢測低表達GALNT4后NCI-H1299細胞凋亡；C Western blot檢測低表達GALNT4后NCI-H1299細胞中GALNT4、MMP-2、MMP-9、Cleaved-caspase-3蛋白表達

表3 低表達GALNT4對NCI-H1299細胞遷移、侵襲和凋亡的影響

2.4 miR-519a-3p靶向調控GALNT4表達 Starbase生物信息學軟件預測顯示，miR-519a-3p與GALNT4的3’UTR存在連續結合的位點。共轉染WT-GALNT4和miR-519a-3p mimics的NCI-H1299細胞熒光光素酶活性低于共轉染WT-GALNT4和miR-NC的NCI-H1299細胞(t=16.660，P<0.05)，而共轉染MUT-GALNT4和miR-519a-3p的NCI-H1299細胞熒光光素酶活性與共轉染MUT-GALNT4和miR-NC的NCI-H1299細胞無顯著變化(t=0.892，P=0.386)。miR-519a-3p組NCI-H1299細胞中GALNT4蛋白表達低于miR-NC組(t=12.489，P<0.05)，anti-miR-519a-3p組NCI-H1299細胞中GALNT4蛋白表達顯著高于anti-miR-NC組(t=4.484，P<0.05)。表明miR-519a-3p靶向負調控GALNT4表達。見圖4，表4、5。

圖4 miR-519a-3p靶向調控GALNT4表達；A starbase對miR-519a-3p和GALNT4結合進行預測示意圖；B Western blot檢測miR-519a-3p對GALNT4蛋白表達的影響

表4 miR-519a-3p對NCI-H1299細胞中GALNT4蛋白表達的影響

表5 雙熒光素酶活性檢測

2.5 高表達GALNT4逆轉高表達miR-519a-3p對NCI-H1299遷移、侵襲和凋亡的影響 miR-519a-3p+pcDNA-GALNT4組NCI-H1299細胞中GALNT4蛋白表達、遷移和侵襲數及MMP-2和MMP-9蛋白表達高于miR-519a-3p+pcDNA-NC組，差異均有統計學意義(P<0.05)，而凋亡率、Cleaved-caspase-3蛋白表達低于miR-519a-3p+pcDNA-NC組，差異均有統計學意義(P<0.05)。見圖5，表6。

圖5 高表達GALNT4逆轉高表達miR-519a-3p對NCI-H1299遷移、侵襲和凋亡的影響；A Transwell檢測NCI-H1299細胞遷移和侵襲(結晶紫染色×200)；B 流式細胞儀檢測NCI-H1299細胞凋亡；C Western blot檢測NCI-H1299細胞中GALNT4、CyclinD1、Cleaved-caspase-3蛋白表達

表6 高表達GALNT4逆轉高表達miR-519a-3p對NCI-H1299細胞遷移、侵襲和凋亡的影響

2.6 Western Blot檢測PI3K/AKT信號通路相關蛋白的表達 miR-519a-3p組NCI-H1299細胞中p-PI3K和p-AKT蛋白表達顯著降低于miR-NC組(P<0.05)；miR-519a-3p+pcDNA-GALNT4組NCI-H1299細胞中p-PI3K和p-AKT蛋白表達顯著升高于miR-519a-3p+pcDNA-NC組(P<0.05)。見圖6，表7。

表7 Western Blot檢測PI3K/AKT信號通路相關蛋白表達

3 討論

miRNA可靶向其靶基因的表達參與調控細胞的增殖、凋亡和分化等過程，與人類腫瘤的發生發展中密切相關[6,7]。研究顯示，miR-519a-3p在耐替莫唑胺(TMZ)的膠質母細胞瘤(GB)細胞中表達降低，上調其表達可靶向抑制RRM1降低耐TMZ的GB細胞增殖、遷移、侵襲和上皮-間質轉化(EMT)[8]；上調miR-519a-3p可靶向抑制PDRG1減弱骨肉瘤細胞的增殖、遷移性及EMT，miR-519a-3p/PDRG1軸為骨肉瘤的治療提供了新的分子靶點[9]。本研究顯示，肺癌細胞系中miR-519a-3p的表達明顯低于肺上皮細胞，提示其可能作為抑癌基因參與肺癌發生發展。通過轉染miR-519a-3p模擬物高表達NCI-H1299細胞中miR-519a-3p后，NCI-H1299細胞遷移和侵襲數顯著減低，且與遷移和侵襲相關的蛋白MMP-2和MMP-9的表達降低，表明高表達miR-519a-3p可抑制肺癌NCI-H1299細胞遷移和侵襲。誘導腫瘤細胞凋亡是腫瘤治療的一種途徑[10]。本研究顯示，高表達miR-519a-3p后，NCI-H1299細胞凋亡率及凋亡相關蛋白Cleaved-caspase-3表達顯著升高，說明高表達miR-519a-3p可誘導NCI-H1299細胞凋亡。

本研究利用雙熒光光素酶報告基因實驗和Western Blot證實了miR-519a-3p靶向負調控GALNT4表達。研究顯示，高表達miR-365通過靶向下調GALNT4表達抑制乳腺癌細胞生長，并增強細胞對氟尿嘧啶的敏感性[11]；miR-506-3p的基因沉默可增強GALNT4的表達，從而加速前列腺癌的發展進程[12]。本研究顯示，GALNT4在肺癌細胞系中呈高表達，低表達GALNT4抑制肺癌細胞的遷移和侵襲性，并促進肺癌細胞凋亡，這與Xing等[13]的結果一致，提示靶向降低GALNT4表達可延緩肺癌發生發展進程。本研究還顯示，高表達GALNT4逆轉了高表達miR-519a-3p對肺癌細胞遷移和侵襲的抑制作用及凋亡促進作用，提示高表達miR-519a-3p通過靶向負調控GALNT4表達發揮來抑制肺癌細胞的遷移和侵襲，并誘導細胞凋亡，miR-519a-3p/GALNT4軸可能為肺癌的分子治療提供了新途徑。

PI3K/AKT信號通路是參與調控腫瘤細胞增殖、分化、凋亡和轉移等過程的重要通路[14,15]。研究表明，過表達miR-141-3p通過靶向下調PTEN并激活PI3K/AKT信號通路促進卵巢癌A2780細胞的增殖和侵襲，并抑制細胞凋亡[16]；miR-489通過靶向HDAC7阻斷了胃癌細胞中PI3K/AKT信號通路的激活，抑制胃癌細胞增殖、遷移和侵襲[17]；miR-425-5p在肺癌組織中表達升高，其通過激活PI3K/AKT信號傳導促進肺癌發生發展[18]。本研究顯示，高表達miR-519a-3p抑制肺癌細胞中PI3K/AKT信號通路的激活，而高表達GALNT4逆轉了高表達miR-519a-3p對肺癌細胞中PI3K/AKT信號通路的抑制作用，提示miR-519a-3p通過靶向負調控GALNT4并抑制PI3K/AKT信號通路來阻礙肺癌細胞遷移和侵襲，并加劇細胞凋亡。

綜上所述，miR-519a-3p在肺癌中呈低表達，高表達miR-519a-3p可有效抑制肺癌細胞遷移和侵襲，并誘導細胞凋亡，其作用機制可能與負調控GALNT4表達并抑制PI3K/AKT信號通路的激活有關。