大黃素對去勢絕經小鼠甘油通道水通道蛋白7表達的組織特異性影響

張仲文 劉志明

圍絕經期綜合征指的是女性在絕經前后表現出的性激素水平不穩定或者降低而引發身體以及心理出現異常癥狀[1]。該病癥的患者年齡越來越小，且發病率不斷上升[2]。現代藥理學研究均表明，大黃素具有抗感染、抗腫瘤以及抗病毒的作用，且在臨床上的應用范圍越來越廣泛[3,4]。水通道蛋白7(AQP7)作為脂肪細胞中表達水平最高的一種甘油通道蛋白，其在絕經后的女性內臟脂肪細胞中的水平也增大，而目前有關AQP7在不同組織中的分布研究較少[5,6]。本研究通過構建去勢絕經小鼠模型，從而探究大黃素對去勢絕經小鼠AQP7表達的組織特異性的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 實驗選用11～13個月的C57BL/6雌性健康小鼠50只[購自廣東省醫學實驗動物中心，合格證號：SCXX(粵)2018-0002]，體重為(35±5)g。小鼠隨機分籠飼養在室溫、相對濕度為(50±5)%的環境中。每天正常喂養小鼠基礎飼料并自由飲水。小鼠在適應環境1周后開始實驗。已得到實驗動物倫理委員會的同意。

1.2 方法

1.2.1 實驗分組：上述50只小鼠隨機分為5組，分別為空白對照組、模型組、大黃素低劑量組(0.5 ml/kg)、大黃素中劑量組(1.0 ml/kg)和大黃素高劑量組(2.00 ml/kg)。在制備小鼠飼料時，于基礎飼料中分別添加不同水平的大黃素即得低、中和高劑量組所需材料。5組小鼠分籠飼養，除空白對照組，其他4組均構建去勢絕經小鼠模型。

1.2.2 去勢絕經小鼠模型的構建以及不同脂肪組織的采樣：采取濃度為30 mg/kg的戊巴比妥鈉對需建模的小鼠做麻醉處理，當小鼠完全麻醉后將雙側卵巢摘除，用濃度為8 000 U/ml的青霉素G鈉溶液沖洗腹腔并做縫合處理，在恢復期通過肌內注射青霉素預防傷口發生感染。術后第4天起，用陰道涂片法來確定卵巢是否完全切除[7]。待模型構建成功，麻醉后于股動脈取血，于3 500 r/min的條件下離心處理10 min，分離血清待檢。脫頸處死大鼠，迅速打開腹腔，采集性腺脂肪(g-Fat)、腹股溝脂肪(i-Fat)及腎周脂肪(p-Fat)組織置于液氮中，后移至-80℃冰箱中保存[6]。

1.3 觀察指標

1.3.1 5組小鼠血清性激素水平比較：根據1.2方法所得血清，按照放射免疫試劑盒相關操作說明測定5組小鼠的血清激素水平，指標包括雌二醇(estradiol，E2)、孕酮(progesterone prog，P)、促卵泡生成素(follicular stimulating hormone，FSH)和促黃體生成素(luteinizing hormone，LH)。

1.3.2 5組小鼠卵巢指數、子宮指數和子宮內膜厚度比較：在小鼠末次灌胃的24 h之后，稱取各小鼠質量，麻醉后脫頸處死，解剖并分離得到子宮和卵巢，將黏附的脂肪和筋膜剔除掉，并使用0.9%氯化鈉溶液沖洗干凈、濾紙吸干稱量子宮和卵巢質量，計算卵巢指數和子宮指數。待稱取完畢后將卵巢用濃度為10%的多聚甲醛固定，制成石蠟切片，蘇木精-伊紅染色后，在光學顯微鏡下觀察并測量子宮內膜厚度。其中子宮指數(mg/g)=子宮濕質量/體質量；卵巢指數(mg/g)=卵巢濕質量/體質量[8]。

1.3.3 5組小鼠不同組織中AQP7 mRNA表達水平比較：根據1.2方法所得脂肪組織，勻漿并提取總RNA，調整RNA濃度至1 μg/μl，反轉錄為cDNA，進行PCR擴增反應。采用2-△△Ct法來測定5組AQP7 mRNA相對表達量，以GAPDH為內參。

1.3.4 5組小鼠不同組織中AQP7蛋白表達水平比較：根據1.2方法所得脂肪組織，提取總蛋白，通過轉膜、封閉、一抗孵育以及二抗孵育后加入發光液顯色拍照，根據內參標準計算目標條帶相對值，采用Western blot法檢測各組小鼠AQP7蛋白表達水平。

1.3.5 5組小鼠雌激素受體基因ERα和ERβ mRNA水平比較：通過Trizol法提取各組小鼠卵巢和子宮組織的總RNA，參照反轉錄試劑盒說明反轉錄為cDNA，按照RT-PCR法測定組小鼠雌激素受體基因ERα和ERβ mRNA水平。

1.3.6 血清性激素對小鼠模型AQP7表達的影響：根據1.2.1、1.2.2和1.2.3結果，分析血清性激素對小鼠模型AQP7表達的影響。

2 結果

2.1 5組小鼠血清性激素水平比較 與空白對照組比較，其余4組小鼠E2和P水平均降低，FSH和LH的水平均升高，且模型組最為顯著(P<0.05)。除空白對照組外，其余3個藥物組與模型組比較，E2和P水平均升高，FSH和LH水平均降低(P<0.05)；大黃素高劑量組對小鼠血清性激素水平的影響幅度顯著高于中、低劑量組(P<0.05)，中劑量組的影響又顯著高于低劑量組(P<0.05)。見表1。

表1 5組小鼠血清性激素水平對比分析

2.2 5組小鼠卵巢指數、子宮指數和子宮內膜厚度比較 與空白對照組比較，其余4個組小鼠卵巢指數、子宮指數和子宮內膜厚度均減小，且模型組最為顯著(P<0.05)。除空白對照組外，其余3個藥物組與模型組相比，卵巢指數、子宮指數和子宮內膜厚度均增大(P<0.05)；大黃素高劑量組對卵巢指數、子宮指數和子宮內膜厚度影響幅度顯著高于中、低劑量組(P<0.05)，中劑量組的影響又顯著高于低劑量組(P<0.05)。見圖1，表2。

空白對照組模型組大黃素低劑量組大黃素中劑量組大黃素高劑量組

表2 5組小鼠卵巢指數、子宮指數和子宮內膜厚度對比分析

2.3 5組小鼠不同組織中AQP7 mRNA表達水平比較 與空白對照組比較，其余4個組小鼠不同組織中AQP7 mRNA均增大，且模型組最為顯著(P<0.05)。除空白對照組外，其余3個藥物組與模型組比較，不同組織中AQP7 mRNA水平增加明顯(P<0.05)；大黃素高劑量組對不同組織中甘油通道水通道蛋白7 mRNA影響幅度顯著高于大黃素中、低劑量組(P<0.05)，大黃素中劑量組的影響又顯著高于大黃素低劑量組(P<0.05)。見表3。

表3 5組小鼠不同組織中AQP7 mRNA表達水平比較

2.4 5組小鼠不同組織中AQP7蛋白表達水平比較 與空白對照組比較，其余4個組小鼠不同組織中AQP7的蛋白水平均增大，且模型組最為顯著(P<0.05)。除空白對照組外，其余3個藥物組與模型組比較，不同組織中AQP7的蛋白水平增大(P<0.05)；大黃素高劑量組對不同組織中AQP7的蛋白影響幅度顯著高于中、低劑量組(P<0.05)，中劑量組的影響又顯著高于低劑量組(P<0.05)。見表4。

表4 5組小鼠不同組織中AQP7蛋白表達水平比較

2.5 5組小鼠雌激素受體基因ERα和ERβ mRNA水平比較 與空白對照組比較，其余4個組小鼠雌激素受體基因ERα和ERβ mRNA水平均減小，且模型組最為顯著(P<0.05)。除空白對照組外，其余3個藥物組與模型組比較，雌激素受體基因ERα和ERβ mRNA水平均增大(P<0.05)；大黃素高劑量組對雌激素受體基因ERα和ERβ mRNA水平影響幅度顯著高于中、低劑量組(P<0.05)，中劑量組的影響又顯著高于低劑量組(P<0.05)。見表5。

表5 5組小鼠雌激素受體基因ERα和ERβ mRNA水平比較

2.6 血清性激素對小鼠模型AQP7表達的影響 直線相關與回歸分析表明，血清性激素與小鼠模型g-Fat和p-Fat中的AQP7表達呈正相關(P<0.05)，i-Fat中的AQP7表達與FSH呈負相關(P<0.05)。見表6。

表6 血清性激素對小鼠模型AQP7表達的影響

3 討論

臨床研究表明，患有圍絕經期綜合征的女性，由于其卵巢功能出現衰退以及雌激素水平降低而導致一系列的神經系統功能紊亂[9,10]。AQP7是脂肪細胞中最主要的甘油通道蛋白，與肥胖的發生存在密切的相關性，而患有圍絕經期綜合征的女性就伴有肥胖[11-13]。目前，有關該病癥的治療大多通過藥物或者激素給予干預，大黃素是一種具有補益精血、強壯筋骨以及強健肝腎功能的良效，該物質的出現給圍絕經期綜合征的治療提供了新的轉機，但作用機制目前尚不明確。

FSH、LH、E2和P四種激素主要是促進卵巢中卵泡的發育以及成熟[14,15]。當女性進入圍絕經期后，卵巢功能就會出現較大的衰退，卵巢內分泌功能也顯著降低，因此雌激素分泌的水平出現減少，導致FSH和LH的水平變大，E2和P則降低，抑制了卵泡的發育和卵子的生長[16]。本研究結果發現，去勢絕經小鼠較健康小鼠的E2和P的水平均降低，FSH和LH的水平均升高；當對去勢絕經小鼠給予大黃素后，E2和P水平均升高，FSH和LH水平則降低(均P<0.05)。

子宮指數和卵巢指數作為評價雌激素水平效應的關鍵指標，指數的變化與雌激素水平呈現正相關[17,18]。本研究結果發現，與健康小鼠比較，去勢絕經小鼠的卵巢指數、子宮指數和子宮內膜厚度均減小；當對去勢絕經小鼠給予大黃素后，卵巢指數、子宮指數和子宮內膜厚度則均增大(P<0.05)。

激素在體內的活性變化是通過相應的受體進行介導的，然而激素受體功能能否正常發揮又會受到調節因子以及受體基因轉錄水平等的影響[19,20]。雌激素在發揮相應的生理作用時主要是受到ERα和ERβ受體介導的。本研究結果發現，與健康小鼠比較，去勢絕經小鼠的雌激素受體基因ERα和ERβ mRNA水平均減小；當對去勢絕經小鼠給予大黃素后，雌激素受體基因ERα和ERβ mRNA水平均增大(P<0.05)。

在本研究中，去勢絕經小鼠的g-Fat、i-Fat以及p-Fat組織中的AQP7的mRNA和蛋白表達水平均顯著增大，表明AQP7參與調節去勢絕經小鼠的脂質堆積；當用大黃素進行干預后，AQP7的mRNA和蛋白表達水平則降低。另外，本研究還發現，血清性激素與小鼠模型g-Fat和p-Fat中的AQP7表達呈正相關，而i-Fat中的AQP7表達與FSH呈負相關，提示AQP7在去勢絕經小鼠體內的表達具有組織特異性，且AQP7的表達水平受到了雌激素的影響，而大黃素則會通過影響雌激素水平從而干預AQP7的表達。

綜上所述，大黃素能夠通過改善去勢絕經小鼠的血清性激素水平從而降低不同組織中甘油通道水通道蛋白7的表達，對小鼠卵巢和子宮有保護作用。