社區獲得性肺炎并發呼吸衰竭患者外周血SOCS-1、TLR4表達及臨床意義

李明旭 朱國清 唐建輝 郁帆 楊志軍

社區獲得性肺炎(community-acquired pneumonia CAP)作為臨床常見疾病，多發于兒童和老年人，常見臨床特征為發熱、咳嗽、咳痰、胸痛、乏力等[1]，而呼吸衰竭是其最常見的并發癥之一，發生率高達18%～36%[2]。研究顯示，CAP患者合并呼吸衰竭后可導致機體嚴重缺氧、二氧化碳潴留、酸中毒進而導致循環、腦、腎等多臟器功能障礙，嚴重威脅患者生命健康[3]。及時評估CAP并發呼吸衰竭患者病情和準確評估預后，對提高患者治療效果有重要意義，現階段臨床評定的常用工具有肺炎嚴重指數和CURB-65評分，但涉及項目多、操作繁瑣，均有一定局限性，因此簡單快速、重復性強的檢查開展更為重要[4]。細胞因子信號轉導抑制因子-1(suppressor of cytokine signaling-1，SOCS-1)是免疫應答及炎性反應的重要調節因子，且與肺部疾病有關[5]。Toll樣受體4(Toll-like receptor 4，TLR4)是一種在免疫反應及非特異性炎癥中發揮重要功能的分子[6]。張新黎等[7]研究表明，重癥肺炎患者體內TLR4基因表達增加，且與炎性因子呈正相關。二者均與肺部疾病有關，且存在靶向調控作用[8]。因此，本研究主要分析SOCS-1、TLR4在并發及未并發呼吸衰竭的CAP患者外周血單個核細胞中的表達差異，及其在患者病情評價及預后評估中的價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2019年1月至2021年3月(收治時長放寬至2年)于本院診治的89例CAP并發呼吸衰竭患者為觀察組，其中男49例，女40例；年齡50～76歲，平均(60.34±8.72)歲；平均體重指數(body mass index，BMI)(23.01±2.98)kg/m2。同期選取本院86例CAP但未并發呼吸衰竭患者作為對照組，男51例，女35例；年齡48～78歲，平均(61.04±9.08)歲，平均BMI(22.94±3.02)kg/m2。對入組患者進行急性生理與慢性健康評分Ⅱ(acute physiology and chronic health evaluation Ⅱ，APACHEⅡ)。同時收集記錄患者高血壓、糖尿病、高脂血癥、吸煙史、肺炎嚴重指數(pneumonia severity index，PSI)等一般資料。

1.2 納入與排除標準

1.2.1 納入標準：①患者年齡≥18歲；②所有患者符合美國胸科學會關于社區獲得性肺炎相關診斷標準[9]；③符合內科學關于呼吸衰竭的診斷標準；④研究符合倫理學標準，經醫院倫理委員會審批通過；⑤患者及家屬知情同意，其資料齊全并完成最終隨訪。

1.2.2 排除標準：①有長期(>3個月)或大劑量(>0.5 mg·kg-1·d-1)的類固醇及其他免疫抑制藥物使用史者，近5年有器官移植或惡性腫瘤史者；②慢性呼吸衰竭(包括慢性阻塞性肺疾病或其他潛在的慢性呼吸系統疾病)。

1.3 主要試劑與儀器 人外周血淋巴細胞分離液(貨號：AP8610)購自上海吉至生化科技有限公司；RNA提取試劑盒(貨號：R1200)購自上海雅吉生物科技有限公司；反轉錄試劑盒(貨號：J-SRP1105-100)購自上海研謹生物科技有限公司；qPCR SYBR?Green Mix(貨號：11202ES)購自翌圣生物科技(上海)股份有限公司。qRT-PCR儀(型號：CFX384)購自美國Bio-Rad公司。

1.4 外周血單個核細胞SOCS-1 mRNA、TLR4 mRNA水平檢測 采集各組受試者入院24 h后空腹靜脈血樣置于含EDTA-K2抗凝劑的真空采血管中，使用人外周血淋巴細胞分離液將真空采血管中的血樣進行單個核細胞分離。提取細胞RNA后將其進行逆轉錄，之后以常規方式進行實時熒光定量PCR(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)反應實驗。qRT-PCR反應體系：cDNA(50 ng/μl)2 μl，上下游引物(10 μmol/L)各0.8 μl，qPCR SYBR?Green Mix 10 μl，ddH2O 6.4 μl。每份樣品設3個重復孔，GAPDH為內參，采用2-ΔΔCT法計算單個核細胞中SOCS-1 mRNA、TLR4 mRNA的相對表達量。ΔΔCT=[(待測樣本目的基因CT值-待測樣本內參基因CT值)-(對照樣本目的基因CT值-對照樣本內參基因CT值)]。見表1。

表1 qRT-PCR引物序列

1.5 治療方法 2組患者入院后均接受抗感染、止咳化痰、維持水電解質平衡等常規治療[9]，CAP并發呼吸衰竭患者，根據病情選擇鼻導管吸氧、高流量氧療、無創及有創機械通氣等合適的氧療方式[10]。同時根據觀察組患者的生存情況(隨訪1個月，截止時間為2021年4月)將其分為生存組70例和死亡組19例。

2 結果

2.1 2組一般資料比較 對照組與觀察組年齡、性別、BMI、高血壓、糖尿病、高脂血癥、吸煙史比較，差異均無統計學意義(P>0.05)。與對照組相比，觀察組PSI評分均較高，差異有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 2組一般資料比較 例(%)

2.2 2組外周血單個核細胞SOCS-1 mRNA、TLR4 mRNA水平及APACHEⅡ評分比較 與對照組比較，觀察組外周血單個核細胞SOCS-1 mRNA、TLR4 mRNA水平及APACHEⅡ評分均較高(P<0.05)。見表3。

表3 2組外周血單個核細胞SOCS-1 mRNA、TLR4 mRNA水平及APACHEⅡ評分比較

2.3 觀察組不同預后患者外周血單個核細胞SOCS-1 mRNA、TLR4 mRNA水平及APACHEⅡ評分比較 與生存組患者比較，死亡組患者外周血單個核細胞SOCS-1 mRNA、TLR4 mRNA表達水平及APACHEⅡ評分均較高，組間差異均有統計學意義(P<0.05)。見表4。

表4 觀察組不同預后患者外周血單個核細胞SOCS-1 mRNA、TLR4 mRNA水平及APACHEⅡ評分比較

2.4 觀察組SOCS-1 mRNA、TLR4 mRNA水平與APACHEⅡ評分的相關性分析 Pearson法分析結果顯示，觀察組SOCS-1 mRNA水平與APACHEⅡ評分呈正相關(r=0.539,P<0.05)，TLR4 mRNA水平與APACHEⅡ評分呈正相關(r=0.613，P<0.05)。見圖1、2。

圖1 觀察組SOCS-1 mRNA水平與APACHEⅡ評分相關性

圖2 觀察組TLR4 mRNA水平與APACHEⅡ評分相關性

2.5 影響CAP并發呼吸衰竭患者預后的多因素Logistic回歸分析 以CAP并發呼吸衰竭患者是否死亡為因變量，排除性別、年齡、BMI、高血壓、糖尿病、高脂血癥、吸煙史、PSI等因素后，以SOCS-1 mRNA、TLR4 mRNA水平及APACHEⅡ評分為自變量進行多因素Logistic回歸分析，結果顯示，SOCS-1 mRNA、TLR4 mRNA水平及APACHEⅡ評分均是影響CAP并發呼吸衰竭患者死亡的重要因素(P<0.05)。見表5。

表5 影響CAP并發呼吸衰竭患者預后的多因素Logistic回歸分析

2.6 外周血單個核細胞SOCS-1 mRNA、TLR4 mRNA評估CAP并發呼吸衰竭患者預后的價值 以外周血單個核細胞SOCS-1 mRNA、TLR4 mRNA水平及二者聯合預測概率值為檢驗變量繪制ROC曲線，結果顯示，SOCS-1 mRNA、TLR4 mRNA及二者聯合評估CAP并發呼吸衰竭患者預后的曲線下面積(area under curve，AUC)分別為0.883(95%CI: 0.793-0.974)、0.878(95%CI: 0.792～0.964)、0.965(95%CI: 0.929～0.998)，且SOCS-1 mRNA、TLR4 mRNA單獨評估AUC均小于二者聯合評估AUC(Z=1.660、1.830，P<0.05)，特異性分別為80.0%、84.3%、84.3%，敏感度分別為84.2%、78.9%、94.7%。見圖3。

圖3 SOCS-1 mRNA、TLR4 mRNA評估CAP并發呼吸衰竭患者預后的ROC曲線

3 討論

CAP是在世界范圍內的公共健康問題，具有較高的發病率及死亡率，相關研究表明CAP患者的死亡率居所有疾病死因中的第3位[11]，呼吸衰竭是CAP最嚴重的并發癥之一。CAP并發呼吸衰竭后病情更為復雜、惡化速度加快，且預后兇險病，病死可高達23%～50%[12,13]。及早客觀、準確的評估此類患者的病情以及預后，并據此在治療過程中及時調整治療方案，有利于臨床醫師合理分配醫療資源、提高治療效果。

SOCS是一類細胞內蛋白，其主要作用是參與酪氨酸蛋白激酶-信號轉導子和轉錄激活子(janus kinase-signal transducer and activator of transcription，JAK-STAT)信號通路的負反饋調節[14]。其中SOCS-1在JAK-STAT信號通路中可作為JAK的假底物來調節其催化活性，進而調控信號轉導[15]。SOCS-1是一種對細胞因子通路有負性調節的蛋白，能干擾腫瘤壞死因子、干擾素、白細胞介素等炎性因子的表達，同時也會被各類細胞因子刺激而表達升高[16]。既往研究顯示，呼吸道疾病往往使得機體對各類病原菌帶來的炎性反應發生免疫應答，進而造成體內細胞因子發生一系列的改變[17]。而本研究結果中并發呼吸衰竭的CAP患者外周血單個核細胞SOCS-1 mRNA水平高于未并發呼吸衰竭患者。推測并發呼吸衰竭的CAP患者因呼吸道炎癥引發免疫應答，此時機體內細胞因子出現異常變化，而SOCS-1作為JAK-STAT信號通路中重要的負反饋調節蛋白，其表達水平上升，進而發生“瀑布”樣級聯反應，在炎性反應中發揮重要調控作用。張金仿等[18]研究顯示，SOCS-1 mRNA在腺病毒肺炎患兒外周血中升高，且具有臨床診斷價值。本研究發現，死亡組并發呼吸衰竭的CAP患者外周血單個核細胞SOCS-1 mRNA水平明顯高于生存組，SOCS-1 mRNA評估CAP并發呼吸衰竭患者預后的AUC為0.883，特異性和敏感度分別為80.0%、84.2%，且SOCS-1 mRNA與患者APACHEⅡ評分呈正相關。這提示SOCS-1不僅能評估CAP并發呼吸衰竭患者病情程度，而且與預后生存狀況有關，并對預后預測有重要價值。

TLR是人體免疫系統中的跨膜受體及病原模式識別受體，其中TLR4與脂多糖作用有關[19]。相關研究顯示，TLR4在機體感染及炎癥的病理生理過程中，可發揮重要調控作用[20]。本研究結果顯示，并發呼吸衰竭的CAP患者及其死亡患者外周血單個核細胞TLR4 mRNA水平明顯較高，且TLR4 mRNA與表征患者疾病嚴重程度的APACHEⅡ評分具有相關性。提示TLR4 mRNA水平的異常升高可能與并發呼吸衰竭或不良預后有關，推測CAP患者并發呼吸衰竭后，TLR4 mRNA表達上調，催化下游轉錄因子，誘導促炎細胞因子過度釋放，進而加重炎性反應，推動患者病情進展。陳源浩等[21]研究表明，TLR4可評估CAP患兒病情，預測近期預后。而本研究中TLR4 mRNA在評估CAP并發呼吸衰竭患者預后中有重要價值，與SOCS-1 mRNA聯合后評估價值有一定的提高，且二者均是影響CAP并發呼吸衰竭患者死亡的重要因素。提示臨床中可通過聯合檢測SOCS-1 mRNA、TLR4 mRNA水平及早評估患者預后，以便及時調整治療方案。

綜上所述，CAP并發呼吸衰竭患者外周血單個核細胞SOCS-1 mRNA、TLR4 mRNA水平均明顯升高，且二者與疾病嚴重程度均有一定的相關性，可作為評估病情程度的生物指標。此外，SOCS-1 mRNA、TLR4 mRNA聯合檢測對CAP并發呼吸衰竭預后有重要預測價值，可指導臨床診療。本研究可為CAP并發呼吸衰竭發病機制的進一步探討提供一定的實驗室依據，有一定的臨床價值。但作為單中心、小樣本的研究，本實驗結果仍需進一步的分析和驗證。