人脂肪源性間充質干細胞修復放化療所致胸腺損傷機制研究

張偉東 張偉威 黨曉健 魏穎 王莉 李靜 王娜

胸腺作為免疫系統的主要調控器官，功能狀態直接決定機體細胞免疫功能，此外還有維持自身免疫、免疫調節及屏障保護等功能。胸腺本身也極易受到損害，眾多引起胸腺衰老因素中，年齡是公認的主要因素，即“胸腺增齡性萎縮(age-related thymic involation)”[1]。但實際臨床工作中放化療藥物通常被認為是損害胸腺最大因素，通過胸腺雙陽性T細胞巨大殺傷性作用，使胸腺細胞大量死亡與空竭，這也是引起胸腺皮質及髓質結構的破壞，直接引起T細胞生存環境受損的主要因素[2]。最終引起免疫系統自我修復能力顯著降低，最終引起此類患者感染及腫瘤復發率高于普通人群，甚至引發嚴重感染或二次腫瘤。脂肪源性間充質干細胞(adipose-derived stem cells,ADSCs)屬干細胞家族，源于發育早期中胚層/外胚層，屬多能干細胞，具備多分化潛能。ADSCs在全身脂肪組織均有分布，臨床可通過吸脂手術獲得，取材簡便，創傷小。研究發現ADSCs因其多分化潛能生物特性廣泛應用于臨床治療，如自體ADSCs軟組織缺損修復，在心肌缺血及神經退行性病變治療應用等[3]。既往不斷有研究證實ADSCs對經放化療照射小鼠胸腺上皮細胞有再生修復增殖作用[4]，但迄今缺乏相關機制報道及體外人體細胞模型相關研究。因此，本研究基于ADSCs生物學特性及既往臨床應用研究基礎，以人脂肪源ADSCs作為體外細胞研究模型，觀察其對化療損傷后胸腺上皮細胞增殖修復作用并對其進行機制探討，為臨床應用提供科學理論指導。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞標本來源:提取細胞脂肪組織由我院普外科手術切除廢棄脂肪組織提供，用含硫酸慶大霉素0.9%氯化鈉溶液充分沖洗切除組織后放置PBS液中，于 30 min內送至實驗室。入選供體均知情同意并簽署知情同意書，獲得醫院倫理委員會批準。小鼠胸腺上皮細胞源于北京大學醫學部免疫教研室贈送。

1.1.2 主要儀器與試劑:①儀器：恒溫飽和濕度CO2培養箱(賽默飛世爾科技有限公司)，酶標儀(美國伯樂公司)，Rotor-Gene QPCR儀(德國凱杰公司)，熒光倒置顯微鏡(BX51，日本Olympus公司)，流式細胞儀(美國BD公司)，旋渦離心機(北京醫療設備廠)，MUSE 細胞分析儀(德國 Merk Millipore公司),Megafuge 離心機(美國Thermo Scientific公司)。②實驗試劑：OPTI-MEM培養基/胎牛血清/胰蛋白酶/P/S雙抗(GIBCO公司)，PE anti-human CD34/FITC anti-human CD44(美國eBioscience 公司)，細胞凋亡檢測試劑盒/細胞周期檢測試劑盒(德國Merk Millipore 公司)，兔抗人GADPH多克隆抗體(康成生物工程公司)，辣根過氧化物酶標記羊抗兔LgG (北京康為世紀生物科技有限公司)，Real Master Mix (SYBR Green)(北京TIANGEN 公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 人脂肪源間充質干細胞分離、培養、鑒定:將脂肪組織放入無菌培養皿中，取出筋膜及血管。以剪刀將脂肪組織剪碎約1 mm3將其放入100 ml離心管中，25～35 ml/管，并加入Ⅰ型膠原酶并封閉處理。37℃水浴、離心、消化、離心、棄去上清，加入含15%胎牛血清培養基轉移至25 ml無菌培養瓶中，于37℃含有5% CO2的培養箱中培養。3 d后首次換液，以后2～3 d 換1次液。細胞貼壁80%～90%瓶底進行細胞傳代(1∶2傳代)。取生長狀態良好第3代細胞進行消化離心，監測細胞密度并計數，調整至1×106個/ml，分裝至EP管，并加入CD44、CD34抗體孵育，用PBS緩沖液沖洗3次，棄上清，重懸，流式細胞儀檢測細胞表面分子，EXP032.V.1.2軟件分析。

1.2.2 siRNA 序列設計:美國國立數據庫(NCBI)查詢KGF序列。siRNA序列設計遵循序列大小19～21 nt，GC 含量在40%～60%；避免可能形成二級結構的區域；從轉錄本AUG起始密碼子開始,搜尋下游AA序列,記錄跟每個AA3’端相鄰的 19 個核苷酸作為候選的 si RNA 靶位點等原則，使用BLAST進行序列同源性分析，排除和其他編碼序列同源的序列，根據以上原則及Ambion公司siRNA target Designer 設計軟件，經BLAST 對比后,提交序列給廣東瑞博公司分別合成靶向 KGF 基因的KGF-si RNA NC-si RNA及熒光標記的 NC-si RNA。

1.2.3 siRNA 轉染、篩選最佳KGF-siRNA濃度:選取對數生長人脂肪源ADSCs細胞，PBS反復沖洗，胰酶消化將細胞數控制在1×105個/ml，取2ml接種至6孔板放入37℃、5% CO2的培養箱中培養，分別制備AB液并室溫下孵育30 min加入對應6孔板中，37℃、5% CO2的培養箱中培養4～6 h后吸出上清液，更換為DMEM培養基2 ml,放回培養箱中以RT-PCR檢測細胞mRNA表達。KGF-siRNA濃度分組：20 μmol/L、30 μmol/L、50 μmol/L及100 μmol/L。

1.2.4 成脂誘導并增殖曲線分析:選取第3代人脂肪源ADSCs，以胰蛋白酶消化接種至6孔板中，細胞濃度1×105個/孔，37℃、5% CO2的培養箱中培養過夜。貼壁后將培養基更換為成脂細胞誘導培養基，換液培養2周后將細胞進行油紅O染色證實細胞中是否有脂滴形成。

1.2.5 FITC-Brdu測定人脂肪源性間充質干細胞增殖實驗：將人脂肪源ADSCs分為脂肪干細胞沉默組、脂肪干細胞未沉默組及單純胸腺上皮增殖組。將3組細胞種植于Transwell小室下層，12 h后可以看到脂肪干細胞基本完全貼壁，將人的胸腺上皮細胞種植與小室的上層，將小室放于培養箱培內培養，測定胸腺上皮細胞增殖情況(主要測第1、2、3天)。

2 結果

2.1 人脂肪源間充質干細胞培養、鑒定 將從脂肪組織分離出來的人脂肪源間充質干細胞種植于培養瓶內，顯微鏡下觀察到大量脂滴，可見少量紅細胞或成纖維細胞，接種48 h后細胞貼壁生長可呈棒槌狀，部分細胞呈細長形似纖維狀，72 h后細胞逐漸分離、融合成單層成簇分布。應用ADSCs表面抗原測定提示表面抗原CD44陽性率93.0%,CD34呈0.405%，確定為ADSCs細胞。見圖1、2。

圖1 ADSCs種植第1天及第3天

圖2 ADSCs 流式細胞圖；A CD44；B CD34

2.2 KGF-siRNA 轉染、濃度篩選、下游蛋白表達

2.2.1 KGF-si RNA轉染、濃度篩選:RT-PCR比較 KGF-siRNA轉染ADSCs后KGF表達，證實KGF-siRNA-2轉染ADSCs中KGF表達下降了81.88%，干擾效果明顯且與KGF-siRNA-1,空質粒組及未轉染組比較存在顯著差異(P<0.001)。KGF-siRNA-2分0.1 μg,0.3 μg,0.5 μg,1.0 μg濃度進行人脂肪源性間充質干細胞轉染篩選最佳濃度，mRNA水平依次下降33.22%，46.60%，81.06%，42.35%，結果提示0.5 μg為KGF-siRNA最佳轉染濃度，且差異有統計學意義(P<0.001)。見表1、2。

表1 篩選KGF-siRNA沉默質粒最佳序列濃度 %

表2 KGF-siRNA-2作用最佳濃度篩選比較

2.2.2 KGF-si RN-2轉染對下游蛋白表達影響:KGF-siRNA 0.5 μg轉染48 h/72 h，比較沉默組、空白組及空質粒組下游蛋白表達差異。結果提示沉默組下游蛋白表達明顯低于空白對照及空質粒組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表3，圖3。

表3 不同時間、KGF-siRNA轉染前后下游蛋白表達比較

圖3 KGF-siRNA 0.5 μg轉染48、72 h，沉默組、空白組及空質粒組下游蛋白表達

2.3 人脂肪源性間充質干細胞對胸腺修復增殖影響

2.3.1 人脂肪源性間充質干細胞分化潛能測定:經成脂誘導6 d后，通過倒置顯微鏡發現少量細胞胞漿且有圓形小顆粒，細胞形態由梭形變為圓形，且脂滴逐漸增多。誘導12 d后細胞體積內充滿圓形脂滴，應用油紅O染色可見細胞內存在紅色脂滴顆粒，對照組細胞形態仍呈梭形且胞質內無脂滴。結果提示人脂肪源性間充質干細胞具備分化潛能，應用Brdu測試KGF-siRNA干擾沉默后脂肪干細胞增殖情況，證實1～3 d內增殖79.3%、93.7%、99.5%。

2.3.2 人胸腺上皮細胞增殖情況:應用Brdu法測定沉默組、對照組及單純細胞組情況。證實對照組增殖顯著高于沉默組及細胞組，差異有統計學意義(P<0.001)。見表4。

表4 人胸腺上皮細胞增殖情況的測定

2.3.3 小鼠胸腺上皮細胞增殖情況:應用Brdu法測定沉默組、對照組及單純細胞組情況。證實對照組增殖顯著高于沉默組及細胞組增殖，差異有統計學意義(P<0.001)。見表5。

表5 小鼠胸腺上皮細胞增殖情況

2.4 胸腺上皮細胞增殖S期測定分析

2.4.1 人胸腺上皮細胞增殖S期測定分析：PI法測定3 d內人胸腺上皮細胞增殖S期細胞增殖情況。證實對照組增殖顯著高于沉默組及細胞組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表6。

表6 人胸腺上皮細胞增殖S期測定

2.4.2 小鼠胸腺上皮細胞增殖S期測定分析:PI法測定3 d內小鼠胸腺上皮細胞增殖S期細胞增殖情況。證實對照組增殖顯著高于沉默組及細胞組增殖，差異有統計學意義(P<0.05)。見表7。

表7 小鼠胸腺上皮細胞增殖S期測定

3 討論

20世紀初通過體外培養ADSCs首次證實其可分泌一系列生長因子進入培養基，形成ADSCs條件培養基促進組織細胞增殖[5]。目前已報道分泌細胞因子主要有堿性成纖維細胞生長因子、角質生長因子(KGF)、轉化生長因子-β(TGF-β)、血管內皮生長因子(VEGF)等[5-7]。作為公認多分化潛能干細胞，可定向分化為中胚層各種細胞，已報道的有脂肪細胞、成骨細胞、成軟骨細胞、骨骼肌細胞及心肌細胞[8]。有研究指出并證實放化療損傷胸腺損傷小鼠模型通過體外輸注ADSCs達到快速修復胸腺結構與功能作用，從而改善了放化療后小鼠免疫能力及感染發生率，延長了小鼠生存時間[9,10]。但相關機制研究及體外研究報道甚少。

人脂肪源性間充質干細胞(human adipose derived mesenchymal stem cells,hAD-MSC)多以人脂肪組織為供體，有著與ADSCs相似的多分化潛能、自我更新及高度繁殖的生物學特性[11]。同時hAD-MSC取材損害小、來源豐富、方便取材、活性持久。為保障實驗細胞系含量及純度，我們以CD34及CD44 分子進行表面抗體鑒定[12]，為機制探討奠定研究基礎。成脂誘導6 d、14 d后，倒置顯微鏡下可見細胞體積內可見逐漸充滿圓形脂滴，油紅O染色體印證為紅色脂肪顆粒，證實hAD-MSC具備良好分化潛能。

角質生長因子是既往報道ADSCs旁分泌修復機制中主要分子，因屬成纖維母細胞生長因子家族(FGFs)，也稱為成纖維細胞生長因子-7(fibroblast growth factor 7,FGF-7)，本身有促進小鼠角質細胞有絲分裂作用[13]。KGF在胃腸、口腔黏膜、胸腺、肺、腎、膀胱、肝等器官損傷修復過程中起到重要作用[14]。KGF與KGFR信號途徑在胸腺間質-上皮相互聯系作用提示KGF在胸腺細胞發育及成熟過程有重要作用[15]。即胚胎期KGF受體缺失小鼠因TEC缺乏增殖及分化能力而出現明顯胸腺生成障礙，伴胸腺細胞數量下降；與KGF受體缺失不同，KGF缺失小鼠表現正常胸腺發育正常，但經照射后KGF缺失小鼠表現胸腺恢復能力下降，提示KGF是生后小鼠胸腺再生必須因素[16]。同時，KGF對胸腺增殖修復功能在老齡鼠萎縮胸腺中也得到證實，并發現有促進成熟T細胞向外周免疫器官輸出的功能[17]。我們發現眾多證實KGF促進胸腺上皮增殖修復功能機制研究中，多以在小鼠/大鼠作為在體研究模型，體外細胞模型研究較少[18]。本研究在KGF-siRNA成功轉染后，依次從RNA及下游蛋白表達證實經小RNA轉染人脂肪源性間充質干細胞KGF表達明顯低于空白對照組及空質粒組，且具備統計學意義，而空白對照組及空質粒組間無統計學意義。同樣，小RNA沉默處理細胞下游蛋白水平表達同RNA水平表達變化一致，即低于空白對照組及空質粒組，具有統計學意義。

在眾多KGF參與胸腺上皮細胞修復機制報道中，KGF與其表達于TEC細胞上KGF受體結合促進胸腺上皮增殖，同時這種受體-配體結合激活下游眾多信號轉導通路，信號轉導通路的激活對胸腺上皮增生、分化及發揮生理效應極為重要[19-21]。本研究證實hAD-MSC通過KGF完成對放化療損傷胸腺萎縮細胞增殖。

綜上所述，我們充分證實hAD-MSC對萎縮胸腺上皮細胞有修復作用，通過KGF-siRNA瞬時轉染，發現其可簡便、快速、準確進行hAD-MSC修復萎縮胸腺機制研究，該機制研究及明確為促進hAD-MSC應用于臨床治療，盡早改善放化療因素引起的患者萎縮細胞修復并改善免疫功能有重要臨床意義。