肺炎鏈球菌血清型監測結果與疫苗覆蓋情況

王穎童 何寶花 張海霞 曹玉雯 賈肇一 孫印旗

肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae,Spn)是常見的條件致病菌之一，正常情況下可寄生于口咽和鼻咽，其引起的細菌性肺炎是社區獲得性肺炎(community-acquired pneumonia,CAP)的重要組成部分，國外報道中占CAP的15%～23.4%[1,2]。Spn在宿主免疫力下降時還可引發腦膜炎、敗血癥等侵襲性疾病(invasive pneumococcal disease,IPD)。Spn細胞壁上的細菌莢膜多糖(capsular polysaccharide,CPS)可保護菌體逃避宿主先天免疫反應，使病原菌可在宿主體內繁殖增長。根據CPS組成和結構不同，Spn可分為近100種血清型[3]，其中與IPD相關的僅有20余種，包括14，4，1，6，7F，23F，18C，19F等[4]。監測血清型別變遷和漂移有利于相關疾病的防控和診療。為抵御肺炎鏈球菌感染23 價肺炎鏈球菌多糖疫苗 (23-valent pneumococcal polysaccharide vaccine,PPV23)首先研發，但其對<2歲兒童保護效果不理想[5]，繼而陸續研發了多種肺炎鏈球菌結合疫苗(pneumococcal conjugate vaccine,PCV)PCV7、PCV10、PCV13等。本研究旨在了解2014至2018年河北省兒童病例來源肺炎鏈球菌血清型分布特點，分析各型疫苗覆蓋率和應用價值。

1 材料與方法

1.1 實驗菌株 本實驗所用肺炎鏈球菌為2014至2018年收集的兒童病例來源菌株累計527株，其中按時間統計包括2014年182株、2015年123株、2016年111株、2017至2018年111株(2017和2018年收集菌株數量較少，為使計算結果、討論趨勢時組間基數相對平衡，將2年的數據合并為一組)。527株樣品菌株分離來源包括：腦脊液、全血、硬膜下積液、胸水、各種穿刺液、痰、分泌物等部位。其中侵襲性菌株192株，占比36.43%，非侵襲性菌株335株，占比63.57%。采樣病例中男335例，女192例，性別比1.74∶1；年齡分布為：<12個月253例、12～24個月163例、>24個月111例。全部菌株已使用PCR檢測肺炎鏈球菌特異基因cpsA進行復核。

1.2 儀器與試劑

1.2.1 主要儀器：生物安全柜(型號：NU-430-600E)產自美國NUAIRE公司；CO2恒溫培養箱(型號：MCO-18AIC)產自日本SANYO公司；比濁儀(型號：DENSIMAT)產自法國梅里埃公司；核酸提取儀(型號：NP968-C)產自中國天隆科技有限公司；PCR擴增儀(型號：DNA Engine PTC-200)產自美國Bio-Rad公司。

1.2.2 主要試劑與耗材：哥倫比亞血平板BAP產自英國OXOID公司，擴增血清型引物由華大基因公司合成，細菌DNA提取試劑盒產自天隆科技有限公司。

1.3 DNA模板的提取 根據DNA提取試劑盒說明書，選取新鮮復核的純培養Spn菌株；使用無菌0.9%氯化鈉溶液配制菌懸液100 μl，13 500×g離心2 min，棄上清；沉淀物中加入溶菌酶180 μl、蛋白酶K20 μl，渦旋混勻，50℃條件下水浴30 min；再加入菌體消化液200 μl，充分混勻；上機，按照既定程序提取細菌基因組DNA。

1.4 多重PCR實驗方法

1.4.1 引物的合成：根據WHO《Laboraory Methods for the Diagnosis of Meningitis caused by Neisseria meningitidis, Streptococcus pneumoniae,and Haemophilus influenzae》手冊推薦的多重PCR擴增方法鑒定菌株血清型。引物參考美國疾病控制與預防中心官網(https://www.cdc.gov/streplab/pcr.html)公布的序列。

1.4.2 實驗順序：按照WHO實驗手冊推薦，將所有引物分成8個反應組(G1～G8)，G1：6(6A/6B/6C/6D)、19A、16F、3、22F/22A，G2：15A/15F、23A、7F/7A、8、33F/33A/37，G3：19F、35B、12F/12A/44/46、11A/11D、38/25F，G4：18(18A/18B/18C/18F)、24(24A/24B/24F)、7C/7B、4、9V/9A，G5：23F、14、1、10A、15B/15C，G6：5、35F/47F、39、10F/10C/33C、17F，G7：34、23B、35A/35C/42、9N/9L、31，G8：20、13、21、2。所有樣本DNA按照G1～G8的順序進行實驗，已經分型成功的樣本不再進行下一組實驗。所有組別均未檢出陽性的樣本，判定為未分型。

1.4.3 反應體系和循環條件：反應總體系50 μl，包括：Master Mix(2×)25 μl；Primer F/R(25 μmol/L)變化；DNA模板5 μl，剩余體積由ddH2O補足。擴增條件：預變性95℃ 15 min、變性94℃ 30 s、退火54℃ 90 s、延伸72℃ 60 s，共循環30次個；再延伸72℃ 10 min。

1.4.4 結果判讀：通過普通電泳，條件設定為120 V、70 min，觀察 PCR實驗條帶，根據實驗手冊給出的相應基因特異性條帶片段大小，研判分型結果。

1.5 統計學分析 應用SPSS 23.0統計軟件，計數資料比較采用χ2檢驗，兩兩比較采用Bonferroni檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 菌株血清型總體分布情況 全部527株菌株中，除40株未分型之外，其他菌株共被分為29個血清型，其中數量較多的包括：19F(176株33.40%)、6(87株16.51%)、19A(57株10.82%)、14(30株5.69%)、23F(20株3.80%)、3(17株3.23%)、1(13株2.47%)、20(13株2.47%)，以上菌株總計413株，達到樣本總量的78.37%。(雖然TC/TB/40型也達到17株，但目前的實驗方法不能精確分型到具體型別；故暫不做比較和討論)比較前五種優勢血清型在侵襲性和非侵襲性菌株中的比重發現，19F型、19A型在非侵襲性菌株的比例明顯高于侵襲性(χ2值分別為18.03、3.89，P<0.05)；14型在侵襲性菌株中的比例明顯高于非侵襲性菌株(χ2=22.24，P<0.01)；6和23F差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 2014至2018年兒童肺炎鏈球菌菌株血清型分布情況

2.2 優勢血清型年度變化規律 匯總主要血清型在幾年中的占比變化發現，19F型一直處于較高位置，但2015年達到高點后出現下降趨勢；19A型2015、2016年出現短時降比，之后又在2017至2018年收集的菌株回升至前期水平；6群在2017至2018年出現了比例下降，而與之形成鮮明對比的是14型在同時間段出現比例明顯上升。23F型因其總數量僅20株，年度占比一直徘徊在5%左右。3型、1型、20型的總數量更低，未能發現明顯的變化趨勢。見表2,圖1。

表2 主要血清型肺炎鏈球菌菌株年度占比 %

2.3 疫苗覆蓋情況 PCV7、PCV10、PCV13、PPV23的總體覆蓋率依次為60.34%、64.33%、78.37%、83.30%。4種疫苗間差異有統計學意義(χ2=93.89，P<0.01)，但進一步使用Bonferroni檢驗(兩兩比較)發現PCV7與PCV10間差異無統計學意義(P>0.05)，PCV13與PCV23間差異無統計學意義(P>0.05)；PCV7和PCV10分別與PCV13和PCV23比較，差異均有統計學意義(P<0.05)。在侵襲性和非侵襲性菌株中的覆蓋率，PCV7疫苗在侵襲性菌株中的覆蓋率明顯高于非侵襲性(χ2=16.57，P<0.001)。PPV23在>2歲兒童來源菌株中的覆蓋率為87.93%，與其在全體菌株中的83.30% 接近。見表3，圖1。

表3 PCV7、PCV10、PCV13、PPV23疫苗覆蓋情況匯總

圖1 主要血清型肺炎鏈球菌菌株年度比重變化

3 討論

本研究收集到的5年樣本中可分型菌株內部，19F和6群是主要血清型，此結果與馮爽等[6,7]研究一致。與某些報道認為的引起侵襲性疾病以19F、19A型較為常見的結論不同[8]，本研究中非侵襲性Spn中19A占第三位，但在侵襲性菌株緊隨19F和6群之后的是14型。

無論19F型或19A型在非侵襲性菌株中的占比水平均顯著高于它們在侵襲性菌株的占比水平。提示可能兩型導致的臨床癥狀會有減輕趨勢。觀察年份分布發現，19F型近年來呈現下降趨勢；而19A型在2017至2018年明顯回升。19F和19A存在型別互換的可能性，原因是莢膜在合成過程中可發生遺傳物質層面的互換[9]。19A占比的顯著上升，不能排除19F部分漂移為19A型的可能性。但由于19A的數量距離19F相差較遠，不能扭轉整體下降的趨勢。提示19F、19A作為主要Spn血清型的優勢正在縮小。

無論在侵襲性還是非侵襲性菌株中6群占比都處于第二位，年度變化來看相對穩定。6群在日本報道中占流行血清型首位[10]，其國外報道中其6群也被認為是耐藥性最高的血清型之一[11]。其比例下降也可能與PCV7的接種有關。

14型菌株數量在2017至2018年收集到的樣本中顯著上升，且14型在侵襲性菌株中整體占比超過了19A型，與陳凱樂等[7]的結果相近。14型在侵襲性菌株中占比也顯著高于其在非侵襲性菌株中的比例，可能提示其所致癥狀相對較重。國外曾報道14型為亞非歐美多地區常見致病血清型[12]、14型在所有年齡段患者分離的Spn菌株中所占比重均是最高的型別之一[13]，不排除其在今后比例繼續上升的趨勢，應引起高度重視。

23F型在本研究中比重排名第五，但總體數量僅20株。與之不同的是，在國內其他研究中，其數量與6群接近甚至更高，提示23F型的占比存在地區差異[6,14]。

本研究中PCV7、PCV10、PCV13的5年綜合覆蓋率為60.34%、64.33%、78.37%，低于歐洲地區、北美地區和哥倫比亞的研究數據[15,16]。本組數據顯示，PCV7、PCV10、PCV13三種疫苗覆蓋的血清型是逐級增多的，但統計發現，PCV7與PCV10間差異無統計學意義(P>0.05)，可能與PCV10僅增加覆蓋1、5、7F這些小眾型別有關。

相對而言，PCV13的覆蓋率相對于前二者則顯著上升，分析可能與其涵蓋了數量較多的19A型關系較大。PCV13可顯著改善保護效果的結論，在前期報道中也屢有出現。數據顯示，英格蘭、威爾士地區發現其可使IPD發病率降低32%[17]，瑞典發現PCV13可顯著降低<2歲嬰幼兒肺炎的發生率[18]，美國應用PCV13 2年后<2歲嬰幼兒肺炎鏈球菌肺炎住院率顯著下降[19]?？梢奝CV13疫苗在實際應用中更為推薦。PCV7作為前期研發的結合疫苗，曾在世界范圍內對兒童鏈球菌感染類疾病的發病率下降產生過重大影響[20]；且曾有研究發現PCV7可顯著降低IPD發病率[21]，與之相呼應，本研究也發現PCV7在侵襲性菌株中的覆蓋率高于非侵襲性。但是由于疫苗選擇性壓力等原因造成的血清型替換，近年來本地收集到的菌株中，PCV7的保護率顯著低于PCV13，結合19F型菌株數量下降，不排除會導致PCV7的保護效果下降的可能性。故仍更加推薦使用PCV13替代PCV7和PCV10。

PPV23可以直接誘導人體內B細胞產生血清型特異性IgM和IgG2抗體，不產生免疫記憶，這些抗體與Spn莢膜多糖特異性結合，促進巨噬細胞和中性粒細胞對細菌的吞噬作用[22]。在《肺炎球菌性疾病免疫預防專家共識》(2017年)中PPV23疫苗被推薦主要應用于>2歲感染Spn或患有PD(肺炎球菌性疾病Pneumococcal Disease)的高風險人群[23]，原因是<2歲兒童免疫系統發育不健全，不能產生保護性免疫應答[22]。本研究中PPV23覆蓋率同樣顯著高于PCV7和PCV10，但不高于PCV13，在侵襲性和非侵襲性菌株間也無覆蓋率的顯著差異，可見對于>2歲兒童，使用PCV13和PPV23均可。

綜上所述，在可分型的菌株中，優勢血清型依次為：19F、6、19A、14、23F型。19F型和19A型對本地肺炎鏈球菌引起感染的比重和癥狀都有可能存在下降或減輕的趨勢，相反6群和14型可能上升或加重。預防肺炎鏈球菌性疾病，推薦使用PCV13替代PCV7和PCV10，不受年齡限制。根據兒童生理特點，>2歲兒童還可注射PPV23進行預防，與注射PCV13相比暫無顯著效果差異。