大黃酸對糖尿病大鼠腎臟纖維化的作用機制

陳亞坤 穆霖 邢玲玲

糖尿病是由多種原因導致機體出現一系列代謝紊亂綜合征，疾病本身并不會對患者生命安全造成威脅，但其引起的大血管、微血管病變、神經病變等慢性并發癥常是威脅患者生命安全、降低生活質量的主要原因。其中糖尿病腎病是糖尿病常見并發癥之一，其根本病理改變為腎臟細胞遭到破壞，導致腎臟功能逐漸削弱、喪失，常以細胞基質病理性聚集為特征性表現[1,2]。炎性反應是誘發并加重腎臟纖維化病情進展的重要原因，在此過程中，炎性因子被激活，造成腎臟細胞發生纖維化[3,4]。大黃酸是從中藥大黃中提取，具有抗菌、抗炎、利尿等作用[5]。但筆者發現目前臨床關于大黃酸治療糖尿病腎臟纖維化的相關研究較少，具體的作用機制尚不明確，本研究主要觀察大黃酸治療糖尿病腎臟纖維化大鼠的療效，以期為未來糖尿病腎臟纖維化的治療方案開辟新的途徑。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 雄性SD大鼠50只，購自南京醫科大學實驗動物管理中心[許可證號： SCXK (蘇) 2013-0016]，大鼠均為清潔級SD，周齡為8～14周，平均(11.2±2.3)周；體重0.18～0.27 kg，平均(0.23±0.03)kg。

1.2 藥物與試劑制備 大黃酸購自西安昊軒生物科技有限公司，純度≥98%，采用二甲基亞砜(蘇州聯雄化工科技有限公司，批號2067B011)充分溶解大黃酸后并稀釋，使其濃度<0.01%，經0.22 μm過濾備用，并將0.01%的二甲基亞砜溶液作為空白對照組。高脂高糖飼料購自北京博泰宏達生物技術有限公司；鏈脲佐菌素購自北京索萊寶科技有限公司，純度≥98%。

1.3 儀器與設備 采用酶聯免疫吸附法檢測大鼠轉化生長因子-β(transforming growth factor，TGF-β)、Toll樣受體4(Toll-like receptor 4，TLR4)抗體、大鼠結締組織生長因子(connective tissue growth factor，CTGF)，CTGF檢測試劑盒由上海骨朵生物科技有限公司提供，其余檢測試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司；美國貝克曼庫爾特商貿有限公司提供的AU5400全自動生化分析儀，酶偶聯速率法測定血尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)，采用氨基酸氧化酶法測定血肌酐(serum creatinine，SCr)；選用德國寶靈曼公司Miditron Junior Ⅱ型分析儀及其配套設備，利用尿干化學法檢測24 h尿蛋白水平(24-hour urine protein quantification，24hUP)。

1.4 主要方法

1.4.1 建立大鼠模型與分組給藥：①建立糖尿病腎病大鼠模型：在購買的50只大鼠中隨機抽取10只作為空白對照組，其余40只大鼠建立糖尿病腎病模型，建模成功后隨機分為4組，即模型組、低劑量大黃酸組、中劑量大黃酸組、高劑量大黃酸組，每組10只。空白對照組大鼠正常飼養，其余40只大鼠給予高糖飼料喂養10周，將鏈脲佐菌素以30 mg/kg經腹部注射，注射3 d后，采取大鼠尾靜脈血液病檢測血糖水平，當血糖水平≥16.7 mmol/L則視為大鼠建模成功。②分組給藥：空白對照組：無任何誘導劑；模型組：高糖飼料喂養；低劑量組：高糖飼養+62.5 μg/ml；中劑量組：高糖飼養+125 μg/ml；高劑量組：高糖飼養+250 μg/ml。所有大鼠除了高糖飼養外，其余時間均在同一環境中生長，期間大鼠均自由進食水。

1.4.2 標本處理與采集：給藥后，禁食12 h，測量所有大鼠的空腹血糖及24 h尿量，檢測大鼠24hUP；采集大鼠股靜脈血液，檢測BUN、SCr水平；大鼠均給予人性化處死，本研究中全部大鼠的處理均符合《關于善待實驗動物指導性意見》[6]中相關意見。

1.4.3 指標檢測與方法：①腎功能各指標：采用上述儀器檢測大鼠24hUP、BUN及SCr。②TLR4、TGF-β、CTGF水平對比：采用免疫組化法檢測TLR4水平:高倍鏡下隨機抽取10個陽性視野，通過Mocti圖像軟件分析計算其光密度，并取平均值作為最終水平；采用酶聯免疫法檢測TGF-β、CTGF水平：將大鼠左腎制作成勻漿，嚴格按照操作規程分析、計算TGF-β、CTGF水平，并記錄對比。③采用 HE染色，普通光學顯微鏡下觀察腎臟組織病理改變

2 結果

2.1 5組腎功能指標比較 相較于空白對照組，4組糖尿病腎病模型大鼠24hUP、BUN、SCr各指標水平均較高，其中高劑量組24hUP、BUN、SCr各指標水平<中劑量組<低劑量組<模型組，差異均有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 5組大鼠腎功能指標比較

2.2 5組TLR4、TGF-β、CTGF水平比較 相較于空白對照組，4組糖尿病腎病模型大鼠TLR4、TGF-β、CTGF水平均較高，高劑量組TLR4、TGF-β、CTGF各指標水平<中劑量組<低劑量<模型組，差異均有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 5組大鼠TLR4、TGF-β、CTGF水平比較

2.3 5組腎臟HE染色觀察 空白對照組顯示大鼠腎間質無異常改變以及無纖維組織增生，模型組、高劑量組、中劑量組、低劑組顯示大鼠腎小球均有不同程度萎縮、腎間質纖維化增生。病度程度依次高劑量組<中劑量組<低劑組<模型組。見圖1。

空白對照組模型組低劑量組中劑量組高劑量組

3 討論

腎臟纖維化是因多種原因導致腎功能下降甚至喪失的過程，糖尿病誘發的腎臟纖維化若得不到及時控制，隨著病情進展可直接發展為糖尿病腎病[7]。因此，及時控制并阻斷腎臟纖維化，對促進患者良性預后具有重要意義。

糖尿病腎病患者機體代謝機制發生紊亂，腎臟固有細胞遭到刺激、破壞，導致炎性細胞分泌增多，并向腎臟浸潤，與此同時，細胞分泌的炎性產物導致腎臟固有細胞逐漸發生纖維化，進而導致腎臟向纖維化轉變[8]。TGF-β、CTGF屬于炎性分泌物，二者之間相互協同，使細胞外基質生成受到抑制，并調節細胞表型，促進成纖維細胞生成，最終造成腎臟纖維化[9]。TLR4屬于跨膜蛋白受體家族成員之一，其可通過刺激機體產生免疫應答，當機體血液水平處于持續較高狀態時，激活腎小球細胞TLR4抗體，介導免疫反應，進而加重炎癥，造成促纖維化因子增加，最終誘發腎臟纖維化[10]。本研究結果顯示，干預后，相較于空白對照組，4組糖尿病腎病模型大鼠24hUP、BUN、SCr、TLR4、TGF-β、CTGF各指標水平均較高，其中高劑量組上述各指標水平<中劑量組<低劑量組<模型組。表明大黃酸能夠通過改善糖尿病大鼠的腎功能各指標水平，降低炎性因子表達水平。究其原因為大黃酸是中藥大黃的主要成分，以其多環節、多成分的優勢在機體內發揮重要作用：(1)通過改善腎臟肥大，減少細胞外基質堆積；(2)腎小球細胞增殖受到抑制，進而降低纖維連接蛋白表達水平；(3)降低腎小管上皮細胞的表型轉化，阻止間質成纖維細胞由靜止期向增殖期轉變[11]；(4)拮抗炎性因子產生，抑制細胞內絲分裂原活化蛋白激酶活性，對TGF-β誘導蛋白質合成作用進行拮抗，繼而保護內皮細胞[12,13]。

綜上所述，大黃酸能夠改善糖尿病腎病大鼠的腎功能各指標水平，降低炎性因子表達、改善腎臟纖維化，其中高劑量的大黃酸效果更明顯。