芹菜素對人肺鱗癌細胞NCI-H520增殖、轉移、凋亡及自噬的影響

劉 萍，耿亞迪，劉云霄，謝彥博，張欣格，張 蕾,，魏 偉

肺癌是全球發(fā)病率和病死率均居高位的一類癌癥，其中，非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)是最常見的形式，肺鱗狀細胞癌(lung squamous cell carcinoma, LUSC)是非小細胞肺癌的一種亞型，目前尚無特效的治療方法[1]。芹菜素是一種天然的生物活性黃酮類分子，在乳腺癌、結腸癌、胃癌等人類癌癥細胞系中被證明能抑制細胞增殖和誘導細胞凋亡[2]，目前尚無關于芹菜素對人肺鱗癌細胞株NCI-H520作用的相關報道。

凋亡和自噬是細胞死亡的兩種主要方式，許多化療藥物可以誘導細胞凋亡，當細胞受到外界刺激時，發(fā)生以目標細胞的形態(tài)變化為特征等的凋亡反應[3]。自噬是一個連續(xù)的過程，能夠清除細胞內變性的蛋白質和受損的細胞器，產生大分子或者能量供細胞進一步重復使用[4]。該研究旨在觀察芹菜素對人肺鱗癌細胞株NCI-H520增殖、轉移的影響，并初步探討芹菜素對NCI-H520細胞凋亡和自噬的作用。

1 材料與方法

1.1 藥品與主要試劑芹菜素(Apigenin, APG) 、順鉑(cis-diamminedichloro-platinum, CDDP) 購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司(貨號：A106676、D109812)；細胞增殖及毒性檢測試劑盒(cell counting kit-8, CCK-8)購自大連美侖生物技術有限公司(批號：MA0218-2-Oct-11F)；Hoechst 33258活細胞染色液(100×)、 細胞增殖示蹤熒光探針(carboxyfluorescein diacetate, succinimidyl ester, CFDA SE)、BCA蛋白質測定試劑盒購自上海碧云天生物技術研究所(貨號：C1018、C0051、P0010)；Annexin V-FITC凋亡檢測試劑盒購自美國BD公司(貨號：556547)；血清、胰酶和RPMI 1640培養(yǎng)基購自以色列BI公司(貨號：04-001-1ACS、03-050-1ACS、01-100-1ACS)；結晶紫購自天津市大茂化學試劑廠(CAS NO:548-62-9)；p62多克隆抗體、GAPDH單克隆抗體購自武漢三鷹生物技術有限公司(貨號：18420-1-AP、60004-1-Ig)；微管相關蛋白1輕鏈3B-Ⅱ(microtubule-associated protein 1 light chain 3B-Ⅱ, LC3B-Ⅱ)、辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔/鼠二抗購自美國Cell Signaling Technology(貨號：3868T、7074P2、7056S)；磷酸氯喹(chloroquine phosphate, CQ)購自美國MCE公司(貨號：HY-17589)；AO染色液購自上海麥克林生化科技有限公司(貨號：A6009)；Transwell小室購自美國Corning公司；24孔板購自美國NEST公司。

1.2 細胞培養(yǎng)NCI-H520細胞由中國科學技術大學附屬第一醫(yī)院(安徽省立醫(yī)院)檢驗科提供，細胞用含10%胎牛血清、1%的青霉素和鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基，于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細胞密度長至80%～90%時消化傳代，用于后續(xù)實驗。

1.3 藥物配制用DMSO作為溶劑，將芹菜素溶于其中并配制成藥物母液，實驗中各組DMSO溶劑濃度不超過0.1%。在1 mg/ml的溶解度范圍內，用超純水配制成1 mmol/L的順鉑母液。藥物分裝后均于-20 ℃冰箱中避光保存。

1.4 細胞增殖水平測定

1.4.1CCK-8法檢測芹菜素或順鉑對細胞活力的影響 將處在對數生長期的NCI-H520細胞以5×103個/孔細胞量接種至96孔板中，待細胞密度長至60%～70%時加入不同濃度的芹菜素(2.5、5、10、20 μmol/L)或順鉑(2.5、5、10、20 μmol/L)作為藥物組分別作用24 h或48 h，同時設空白對照組，最后，吸凈培基，加入100 μl配制好的10% CCK-8溶液，在細胞培養(yǎng)箱中孵育1～2 h后，使用酶標儀在450 nm波長處讀取吸光度值。

1.4.2CFDA SE熒光探針檢測芹菜素對細胞分裂能力的影響 熒光標記(1～5)×106個NCI-H520細胞，均勻種至6孔板中，3×105個/孔，隨后可按照細胞的正常培養(yǎng)方法進行培養(yǎng)，細胞長至60%～70%時依序加入不同濃度芹菜素(5、10、20 μmol/L)或順鉑(2.5、5、10 μmol/L)培養(yǎng)48 h，用流式細胞儀檢測熒光值大小。

1.5 細胞遷移、侵襲水平測定

1.5.1劃痕實驗檢測芹菜素對細胞遷移能力的影響 用尺子和記號筆在6孔板的底部0.5～1 cm處均勻地畫出水平線，然后將細胞以3×105個/孔的密度接種到6孔板中，在含有10%胎牛血清的RPMI 1640培基中培養(yǎng)，待細胞密度長至80%～90% 時用200 μl無菌移液管尖端制造垂直于水平線的劃痕，加入不同濃度的藥液，分別于0、24、48 h間隔時間在倒置顯微鏡下采集圖像，觀察各組細胞遷移情況。

1.5.2Transwell實驗檢測芹菜素對細胞遷移、侵襲能力的影響 Transwell遷移實驗中，在10 cm培養(yǎng)皿中培養(yǎng)細胞，待細胞長至60%～70%時，加入不同濃度芹菜素(5、10、20 μmol/L)，12 h后將含有200 μl無血清RPMI 1640培基的106個細胞接種到Transwell小室的上室中，并在下室中加入800 μl含有20%胎牛血清的RPMI 1640培基。72 h后，上室未遷移的細胞用棉簽清潔，Transwell小室用多聚甲醛1 ml固定15 min，PBS漂洗3次，0.1%結晶紫1 ml染色20 min，染色結束后，PBS漂洗3次，在顯微鏡下對遷移的細胞進行拍照記錄。細胞侵襲實驗中，于聚碳酸酯膜的上側涂有Matrigel膠，Matrigel膠加藥前一晚與無血清RPMI 1640培基1 ∶7比例混合涂至上室，在24孔板中放置于37 ℃培養(yǎng)箱中，接種細胞前先用無血清培基水化基底膜30 min后，吸凈無血清RPMI 1640培基再接種細胞。后續(xù)步驟同遷移實驗。

1.6 細胞凋亡測定

1.6.1Annexin V/PI 雙染法檢測芹菜素對細胞膜磷酯酰絲氨酸外翻的影響 將對數生長期細胞以3×105個/孔細胞接種到6孔板中，用不同濃度的芹菜素(5、10、20 μmol/L)作用48 h后收集細胞，同時設空白對照組，用冷PBS洗滌2次，1 500 r/min, 離心5 min，用1 ml的1×Annexin V結合液對細胞進行重懸，吸取100 μl懸液(約1×105個細胞)轉移到1.5 ml的離心管中，分別加入5 μl Annexin V和5 μl PI染液，室溫避光孵育15 min，用流式細胞儀進行檢測。

1.6.2Hoechst 33258染色實驗檢測芹菜素對細胞核的影響 將對數生長期的NCI-H520細胞以3×105個/孔細胞接種至6孔板中，加入不同濃度的芹菜素(5、10、20 μmol/L)作用48 h，同時設空白對照組。48 h后棄除藥液，PBS清洗后用多聚甲醛固定，每孔加入1 ml Hoechst 33258染色液于培養(yǎng)箱中孵育15 min，PBS清洗2次，用熒光顯微鏡進行觀察并拍照。

1.7 細胞自噬水平測定

1.7.1AO染色檢測芹菜素對細胞內酸性細胞器的影響 不同濃度芹菜素(5、10、20 μmol/L)處理NCI-H520細胞48 h后，在胰酶中將細胞進行消化，用預冷的PBS洗滌細胞2次。細胞中加入含1 μg/ml AO染液的PBS溶液，在培養(yǎng)箱中孵育15 min，PBS洗滌細胞3次，用流式細胞儀對熒光強度進行統(tǒng)計分析。

1.7.2電鏡檢測芹菜素對細胞內自噬雙分子層的影響 分組處理完畢的NCI-H520細胞制成細胞懸液并離心，加入預冷的2.5%戊二醛固定液于4 ℃固定12 h，經0.05% mol/L ph7.2的二甲胂酸鈉-鹽酸緩沖溶液漂洗后每管加入1滴1%鋨酸固定液后固定1 h，將標本分別浸入30%、50%乙醇脫水各10 min，每管加入70%乙醇醋酸鈾染色液放置3 h或過夜進行包埋前染色。將標本分別浸入80%、95%、100%乙醇和環(huán)氧丙烷各脫水10 min、15 min，兩次50 min、30 min。浸透時，環(huán)氧丙烷 ∶環(huán)氧樹脂=1 ∶1, 1～2 h；純環(huán)氧樹脂2～3 h。45 ℃烘箱12 h，再放入72 ℃烤箱24 h；取出包埋塊修塊后超薄切片、銅網撈片、電子染色(鉛染色)，最后用透射電鏡觀察及拍片。

1.7.3Western blot檢測芹菜素對自噬相關蛋白的影響 分組處理完畢的NCI-H520細胞在蛋白質裂解緩沖液中裂解30 min，并在 4 ℃下以11 510 r/min, 離心15 min，蛋白質濃度用BCA蛋白質測定試劑盒定量，電泳、轉膜結束后，用新鮮的5%脫脂牛奶在室溫下封閉2 h。將膜與特異性一抗(p62、LC3B、GAPDH抗體稀釋比例均為1 ∶1 000)在 4 ℃下孵育過夜，用TBST洗滌后，將膜與辣根過氧化物酶偶聯的二抗(山羊抗兔、鼠二抗，比例為1 ∶10 000)于室溫緩慢孵育1 h，將漂洗后的PVDF膜置于曝光儀中，滴加化學發(fā)光液，曝光并保存結果。

2 結果

2.1 芹菜素對NCI-H520細胞增殖能力的影響芹菜素(2.5、5、10、20 μmol/L)或順鉑(2.5、5、10、20 μmol/L)作用細胞48 h，圖1A中的結果表明，相對于對照組細胞，芹菜素(F=7.256, 24 h;F=30.39, 48 h;P<0.05)或順鉑(F=2.507, 24 h;F=80.28, 48 h;P<0.01)抑制NCI-H520細胞活力并呈時間和濃度依賴性。在倒置顯微鏡下觀察發(fā)現，空白對照組細胞貼壁生長、形態(tài)完整且邊界清晰；隨著芹菜素或順鉑作用濃度的增加，細胞皺縮，體積縮小，數目減少，見圖1B。圖1C顯示，與空白對照組相比，熒光強度隨著藥物濃度的增加依次升高(F=4.799,F=76.24;P<0.05)。

圖1 芹菜素或順鉑對NCI-H520細胞增殖的影響

2.2 芹菜素對NCI-H520細胞遷移、侵襲能力的影響圖2A結果顯示，芹菜素加藥組劃痕愈合率較對照組下降，且48 h時更為明顯，加藥組的水平遷移能力受到了一定的抑制。Transwell實驗(圖2B、C)結果表明，與對照組相比，芹菜素加藥組穿過小室的細胞數目有所減少，說明芹菜素對細胞的遷移能力(F=48.91,P<0.01)及侵襲能力(F=241.0,P<0.01)具有一定的抑制作用。

圖2 芹菜素對NCI-H520細胞轉移的影響

2.3 芹菜素誘導NCI-H520細胞凋亡作用圖3A結果表明，與對照組相比，芹菜素加藥組的細胞凋亡率增加，且呈現濃度依賴性(F=139.3,P<0.05)。在熒光顯微鏡下觀察核染色情況，圖3B顯微鏡觀察結果顯示，芹菜素加藥組細胞核濃染并縮小，而空白對照組細胞無此現象。

圖3 芹菜素對NCI-H520細胞凋亡的影響

2.4 芹菜素對NCI-H520細胞自噬作用的影響流式結果表明(圖4A)，芹菜素處理后，NCI-H520細胞中酸性細胞器的數量增加，差異有統(tǒng)計學意義(F=4.616,P<0.05)。電鏡下觀察(圖4B)，對照組細胞形態(tài)正常，胞體飽滿，核膜、質膜完整，芹菜素加藥組細胞腫脹，線粒體、內質網等細胞器出現碎片跡象，細胞內出現自噬雙分子層樣結構。Western blot檢測結果顯示(圖4C)，隨著芹菜素濃度的增加，LC3B-Ⅱ蛋白表達水平升高，說明芹菜素誘導細胞內自噬體的增加(F=41.50,P<0.05)，p62蛋白水平隨著芹菜素濃度的增加而升高(F=27.39,P<0.01)，加入自噬抑制劑CQ(5 μmol/L)后，芹菜素(20 μmol/L)組與芹菜素(20 μmol/L)聯合自噬抑制劑CQ(5 μmol/L)組LC3B-Ⅱ、p62蛋白表達差異無統(tǒng)計學意義(F=38.4, NS;F=17.90, NS)。

圖4 芹菜素對NCI-H520細胞自噬水平的影響

3 討論

作為一種天然黃酮類化合物，芹菜素具有低毒性和潛在的抗腫瘤藥理作用，無論是單獨使用還是與其他化療藥物聯合使用，都在多種腫瘤中顯示出潛在的抗癌作用[5]，如：肝癌[6]、卵巢癌[7]、膠質瘤[8]等，同時在腫瘤耐藥方面也有一定的作用[9]。文獻[10]表明，芹菜素可以誘導癌細胞凋亡。凋亡被稱為Ⅰ型程序性細胞死亡，細胞受到外界凋亡刺激后，通過細胞內發(fā)生信號級聯反應，表現出如細胞變圓，體積縮小，結構更加緊密，脫離周圍的細胞；胞漿濃縮，核染色質密度增高，核膜核仁破碎，膜內側磷脂酰絲氨酸外翻到膜表面，胞膜出芽、脫落，包裹著細胞形成凋亡小體等一系列凋亡特征[11]。該研究表明芹菜素可以誘導細胞磷酯酰絲氨酸膜外翻，凋亡率增加，并促進細胞核固縮及染色質凝集，提示芹菜素可以誘導NCI-H520細胞凋亡。

自噬在腫瘤中所發(fā)揮的作用在近年來逐漸受到廣泛的關注。自噬可以促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展，同時也可以誘導腫瘤細胞死亡，因此也被稱為Ⅱ型程序性細胞死亡。自噬過程中會形成自噬雙分子層結構，該實驗在電鏡下觀察，結果顯示芹菜素可誘導細胞內自噬雙分子層結構的形成。同時，在自噬的發(fā)生過程中，LC3B-I會轉變成膜型LC3B-Ⅱ。該研究表明細胞內LC3B-Ⅱ蛋白水平升高。以上結果表明芹菜素可以誘導細胞內自噬體的生成。自噬的過程需要酸性細胞器溶酶體參與降解過程，AO是一種特異性染料，它能透過胞膜完整的細胞，嵌入細胞核DNA，使之發(fā)出明亮的綠色熒光，也可以滲透進入酸性細胞器如自噬溶酶體[12]。AO流式結果表明，芹菜素可以引起細胞內酸性細胞器的增加，說明其促進了自噬的產生。

自噬是一個動態(tài)的過程，該實驗檢測p62蛋白的表達，以進一步驗證自噬體增加的原因。自噬相關蛋白p62是一種支架蛋白和經典的接頭蛋白，是自噬選擇性底物，參與自噬體的降解[13]。該研究顯示芹菜素可以誘導細胞內p62蛋白水平的升高，表明自噬體降解減少。在酸性溶酶體中，CQ會使溶酶體pH值升高，使溶酶體中酸性水解酶失活，從而抑制細胞內自噬溶酶體的融合與降解。CQ處理細胞會導致LC3B-Ⅱ的聚集，在CQ的存在下，細胞中LC3B-Ⅱ水平未能增加，表明芹菜素與CQ類似地可以阻斷晚期自噬通量，而不是促進自噬啟動。因此芹菜素誘導細胞自噬體的增加可能是由于抑制了自噬體的降解。

該研究用不同濃度的芹菜素處理人肺鱗癌細胞NCI-H520，初步探討其對于細胞增殖、轉移的影響以及可能的作用機制。該研究結果中，芹菜素作用于NCI-H520細胞后，細胞活力下降，分裂能力減弱，形態(tài)發(fā)生明顯變化，遷移和侵襲的數量明顯減少，表明芹菜素能夠抑制人肺鱗癌細胞的增殖、遷移、侵襲能力，其抑制細胞的生長轉移可能與誘導其凋亡和自噬有關。由于細胞及化合物的不同，自噬發(fā)揮不同的作用，因此自噬產生的具體機制有待進一步研究，以實現腫瘤的靶向治療[14]。