miR-30b在三叉神經痛模型大鼠中的表達及作用

胡婷婷，何 帆，劉明政，徐文華，王元銀

三叉神經痛(trigeminal neuralgia，TN)是頜面外科臨床常見的一種神經病理性疼痛，嚴重影響患者的生活質量及心理健康[1-2]。卡馬西平等藥物治療易出現疲勞、頭昏等副作用[1,3]。注射治療、射頻溫控熱凝和手術等方法也仍不能達到理想的治療效果[1,3]。因此進一步探索TN發生的機制，尋找更精確有效的治療方法，已成為近年來的研究熱點[2,4]。

miR-30b是miR30家族的成員，參與了多種疾病的發病機制，與神經性疼痛、神經退行性疾病等有關[5-6]。目前關于TN模型大鼠三叉神經節(trigeminal ganglion,TG)中miR-30b的研究較少。激活轉錄因子3(activating transcription factor 3,ATF3)與周圍神經損傷特異性相關，被用作神經損傷的特定標記物[7-8]。故本研究建立大鼠TN模型，通過機械痛閾測定及ATF3輔助驗證模型，探索miR-30b是否參與調控TN的發生。

1 材料與方法

1.1 實驗主要試劑、儀器Von Frey 毛刷(美國North Coast公司)；Tissue RNA Purification Kit Plus(上海奕杉生物科技有限公司組織)；PrimeScriptTMRT Reagent Kit(Perfect real Time)(日本TaKaRa生物科技有限公司) ；TB Green?Premix Ex TaqTMⅡ(Tli RNaseH Plus)(日本TaKaRa生物科技有限公司)；Hairpin-itTM microRNA and U6 snRNA Normalization RT-PCR Quantitation Kit(上海吉瑪制藥技術有限公司)；熒光定量PCR儀(美國Thermo Scientific公司)；KZ-Ⅲ-F高速低溫組織研磨儀(武漢賽維爾生物科技有限公司)；SDS-PAGE凝膠配制試劑盒(上海碧云天生物技術有限公司)；ATF3 Antibody(江蘇親科生物研究中心有限公司，DF6660)；miR-30b agomir、miR-30b agomir NC(上海吉瑪制藥技術有限公司)。

1.2 實驗動物及TN模型的構建

1.2.1實驗動物 選用體質量(180～200) g的成年雄性 Sprange-Dawley(SD)大鼠，常規飼料飼養，自由飲水，飼養溫度控制在22 ℃～25 ℃，12 h交替照明。動物實驗通過安徽醫科大學實驗動物倫理委員會批準(批號：LLSC20190705)。實驗動物均由安徽醫科大學實驗動物中心提供。

1.2.2TN模型的構建 選用眶下神經縮窄術(infraorbital nerve-chronic constriction injury，ION-CCI)構建TN動物模型。首先對大鼠進行1周的手術前適應性訓練，剔除對Von Frey毛刷過于敏感或遲鈍的大鼠，并篩選出經適應性訓練后毛發和觸須完整的大鼠用于TN模型的構建。大鼠稱重后腹腔注射10%水合氯醛，待大鼠全身麻醉后，在左側眶下顴弓和鼻骨結合處作一切口，長約5 mm，切口與鼻翼平行，玻璃分針分離眶下神經。ION-CCI組大鼠用兩根5-0絲線結扎眶下神經，結扎線間距約2 mm。結扎力度適中，使眶下神經受到輕微壓迫但未阻斷其血液循環為宜。結扎完成后用3-0絲線縫合皮膚創口，涂抹紅霉素軟膏以預防創口感染[3,9]。

1.3 實驗分組

1.3.1miR-30b在TN大鼠三叉神經節中的表達 將SD大鼠隨機分成2組，即ION-CCI組及假手術組(Sham組)，6只/組。ION-CCI組于大鼠左側行眶下神經縮窄術，Sham組除不結扎眶下神經外，其余手術步驟均與ION-CCI組相同。采用Von Frey毛刷分別測試大鼠術前1 d和術后10個時間點(術后2、4、6、8、10、12、14、16、21、28 d)時術側觸須墊區域的機械痛閾，記錄閾值并對大鼠不同時間點的機械痛閾進行統計分析。通過實時定量免疫熒光反應(qRT-PCR)及免疫印跡(Western blot) 檢測術側三叉神經節(TG)內ATF3和miR-30b表達變化。

1.3.2miR-30b表達變化對TN大鼠的影響 將SD大鼠隨機分成3組，即ION-CCI組、ION-CCI+miR-30b agomir組及ION-CCI+scramble組，7只/組。ION-CCI造模術后第12天10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，經眶下孔分別將miR-30b agomir、agomir NC(20 μmol，10 μl)1次/d，連續4 d定位注射到ION-CCI+miR-30b agomir組及ION-CCI+scramble組大鼠TG內[10]。每次給藥前及最后一次注射給藥后1 d，使用Von Frey毛刷進行機械痛閾測定。最后一次注射給藥后1 d處死大鼠，采集術側TG，通過qRT-PCR以及Western blot方法對各組大鼠TG中ATF3和miR-30b表達量進行檢測及對比。實驗所用微小RNA(microRNA，miRNA)序列見表1。

表1 miRNA序列(5′-3′)

1.4 機械痛閾測定測試于每日16：00～17：00間進行，測試前將大鼠置于安靜環境中適應1 h，用 Von Frey毛刷從最小刺激強度開始依次遞增刺激大鼠術側觸須墊區域，每根毛刷重復刺激5次，每次間隔時間不少于30 s，直到某一毛刷激發大鼠重復出現以下任一陽性反應3次：① 快速縮頭、躲避毛刷的行為；② 快速抓咬毛刷的攻擊行為；③ 連續搔抓術側受刺激部位皮膚的行為。此時記錄該毛刷所代表的刺激強度即為機械痛閾，并對大鼠不同時間點的機械痛閾進行統計分析。

1.5 qRT-PCR采集大鼠術側TG，采用Tissue RNA Purification Kit Plus(上海奕杉生物科技有限公司)提取mRNA及miRNA；PrimeScript TM RT Reagent Kit(日本TaKaRa生物科技有限公司)、TB Green?Premix Ex TaqTMⅡ(日本TaKaRa生物科技有限公司)、Hairpin-itTM microRNA and U6 snRNA Normalization RT-PCR Quantitation Kit(上海吉瑪制藥技術有限公司)進行 cDNA的合成和PCR的擴增；熒光定量PCR儀檢測TG中ATF3及miR-30b的表達情況。使用 2-ΔΔCt計算其相對表達水平。實驗所用熒光定量PCR基因引物序列見表2。

表2 熒光定量 PCR 基因引物序列

1.6 Western blot采集大鼠術側TG組織，稱重后每1 mg組織加入含1%PMSF的10 μl RIPA裂解液，置于KZ-Ⅲ-F高速低溫組織研磨儀中研磨。4 ℃、12 000 r/min 條件下離心10 min，吸取上清液。加入相應體積的 5X SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液，100 ℃加熱10 min使蛋白充分變性，-20 ℃下保存待用。使用10% SDS-PAGE凝膠配制試劑盒制備凝膠，上樣電泳后轉模至PVDF膜上，TBST洗滌液反復洗滌3次，每次10 min，置于5%脫脂奶粉中，室溫下搖床封閉2 h。置于一抗稀釋液中(ATF3 Antibody 1 ∶1 000，江蘇親科生物研究中心有限公司，DF6660；GAPDH Zsbio，TA-08)，4 ℃下孵育過夜。PVDF 膜充分漂洗后置于已稀釋好的二抗中室溫孵育1.2 h。PVDF膜充分漂洗，置于顯影機內設置條件曝光成像，使用Image J軟件對曝光后的蛋白條帶圖灰度值進行統計分析，檢測ATF3蛋白的相對表達水平。

1.7 統計學處理采用Grahpad Prism 8.0軟件進行分析，ION-CCI組及Sham組兩組間qRT-PCR 實驗及Western blot 實驗數據比較采用獨立樣本t檢驗。機械痛閾測定結果采用雙因素方差分析。ION-CCI組、ION-CCI+scramble組及ION-CCI+miR-30b agomir組qRT-PCR 實驗和 Western blot 實驗數據采用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 大鼠TN模型構建成功機械痛閾測定結果顯示ION-CCI組大鼠術后第2～28天機械痛閾低于Sham組。術后第2天ION-CCI組大鼠機械痛閾即開始降低[Sham 組: (1.33±0.16) g，ION-CCI 組: (0.70±0.24) g]，在術后第12天時疼痛閾值達到最低[Sham 組: (1.53±0.39) g，ION-CCI組: (0.11±0.06) g]，且直至術后28天ION-CCI組大鼠機械痛閾仍低于Sham組[Sham 組: (1.53±0.39) g，ION-CCI組: (0.32±0.12) g]，F=3.965，P<0.05，見圖1。qRT-PCR結果顯示術后第12天ION-CCI組大鼠TG中ATF3 mRNA表達較Sham組升高，t=5.780，P<0.05，見圖2A。Western blot結果顯示術后第12天ION-CCI組大鼠TG中ATF3 蛋白表達較Sham組升高，t=11.18，P<0.05，見圖2B。以上結果表明TN模型構建成功。

圖1 ION-CCI組及Sham組大鼠在造模術后不同時間點機械痛閾的變化與 Sham組比較：**P<0.01，***P<0.001

圖2 ATF3在ION-CCI組大鼠術側TG中的的表達與Sham組比較：**P<0.01，***P<0.001

2.2 TN大鼠的術側TG中miR-30b表達降低qRT-PCR結果顯示在術后第12天，與Sham組相比，ION-CCI組大鼠TG中miR-30b的相對表達量降低，t=6.505，P<0.05，見圖3。

圖3 miR-30b在ION-CCI組大鼠術側TG中的表達與Sham組比較：**P<0.01

2.3 miR-30b類似物對TN大鼠TG內ATF3的表達的影響注射miR-30b類似物后，與ION-CCI組及ION-CCI+scramble組相比，ION-CCI+miR-30b agomir組機械痛閾升高，F=21.20，P<0.05；qRT-PCR結果顯示ION-CCI+miR-30b agomir組大鼠TG中ATF3 mRNA表達降低，F=8.562，P<0.05；Western blot結果顯示ION-CCI+miR-30b agomir組大鼠TG中ATF3 的蛋白表達降低，F=8.353，P<0.05，見圖4。ION-CCI組與ION-CCI+scramble組大鼠機械痛閾及TG內ATF3的表達差異無統計學意義。

3 討論

miRNAs是一類長度為18～25個核苷酸的非編碼RNA[11]。超過30%的人類蛋白編碼基因可能受到這些miRNAs的調控[12]。成熟的單鏈miRNA可通過序列完全互補的方式與靶基因mRNA 3’非翻譯區相結合，降解mRNA或抑制mRNA的翻譯[11]。miRNAs在病理狀態下表達異常，可能是一個潛在的治療靶點[11]。近年來miRNAs在疼痛中的作用受到越來越多的關注，逐漸成為鎮痛治療的一個新方向[6]。CCI慢性坐骨神經縮窄性損傷后，大約有111種miRNAs表達異常[13]。Shao et al[14]研究發現在脊神經損傷模型SNL中，miR-30b可通過抑制Nav1.7的表達緩解大鼠的神經性疼痛。Su et al[15]研究發現在脊神經損傷模型SNL中，miR-30b可通過抑制大鼠背根神經節神經元和脊髓中Nav1.3的表達來減輕神經性疼痛。目前miRNAs對痛覺調控機制的研究主要集中在背根神經節、脊髓組織和坐骨神經痛等，對其在TN中的作用研究較少。故本研究重點關注miR-30b在TN模型大鼠TG內的表達及作用。

采用眶下神經縮窄模型建立TN是由Vos et al[16]于1994年首次提出的一種經典的造模方法，改編自Bennett和Xie[17]的坐骨神經慢性結扎模型，能再現TN的重要方面，模擬出TN的自發性疼痛及異常性疼痛(痛覺過敏)，通過對大鼠術側觸須墊區域進行機械痛閾測定來判斷造模是否成功[3,9]。ATF3是一種轉錄因子，也是損傷的初級傳入神經元的敏感標記物，與周圍神經損傷特異性相關。ATF3在許多不同組織中被應激信號誘導。在疾病和損傷的動物研究中，包括神經結扎、HIV、糖尿病和神經毒素等誘導的神經病變，ATF3被用作神經損傷的特定標記物,可以很好地標記那些組織損傷后長期致敏的神經元[8]。故在測定大鼠機械痛閾之外，本研究通過檢測TG中ATF3的表達變化輔助驗證SD大鼠ION-CCI所構建的TN動物模型。

實驗結果表明，與Sham組相比，ION-CCI組術后第2～28天機械痛閾降低，術后第12天達到最低值；術后第12天ION-CCI組TG中ATF3 mRNA及蛋白表達升高，提示TN模型建立成功。ION-CCI組術后第12天TG中miR-30b表達降低，提示miR-30b參與了TN的發生。為進一步了解miR-30b表達變化對TN大鼠的影響，在ION-CCI術后第12天，當大鼠TN模型穩定構建時，經眶下孔分別將miR-30b agomir、agomir NC 1次/d，連續4 d定位注射到ION-CCI+miR-30b agomir組及ION-CCI+scramble組大鼠TG內。實驗結果顯示miR-30b類似物干預后，TN大鼠機械痛閾升高，TG內ATF3表達降低。提示過表達miR-30b，不僅可以有效抑制TN引起的ATF3的上調，還能使大鼠的機械痛閾升高，緩解ION-CCI誘導的TN，從而確定了miR-30b可能是TN潛在的治療靶點。

目前認為TN的實質可能是一種過度興奮，表現為血管受壓后脫髓鞘的三叉神經出現異常放電或異位動作電位[18]。電壓門控鈉離子通道(Voltage-gated sodium channels，VGSC)在神經元動作電位的啟動和產生中起著至關重要的作用[2]。研究[14-15]

圖4 各組大鼠眶下區定位注射不同時間點機械痛閾及術側TG中ATF3的表達變化

證實，某些miRNA可通過調節VGSC表達和神經元興奮性，參與神經性疼痛的發展。通過生物信息學預測發現miR-30b與VGSC亞型Nav1.3高度相關。由此推測在正常生理狀態下，miR-30b能夠抑制SCN3A(Nav1.3編碼基因)由mRNA到Nav1.3蛋白的翻譯。在外周神經受到損傷時，miR-30b表達下調從而減少對Nav1.3 mRNA的抑制，Nav1.3表達增加，引起神經元興奮性增強，從而誘發TN。后續實驗將進一步深入探究miR-30b調控TN的潛在機制，為TN的治療研究提供新的方向。