全身動態18F-FDG PET/CT Patlak顯像評價大鼠膠質瘤放療增敏早期療效

蔡 可，張晴晴，余文靜，薛楊央，汪 會，徐慧琴

放射治療是膠質瘤術后的主要治療方法，然而，由于膠質瘤高度缺氧和巨大異質性常導致預后不良[1]。研究[2]表明，放射增敏劑是解決腫瘤放療耐受的有效手段之一。正電子發射計算機斷層顯像(positron emission computed tomography, PET/CT)在腫瘤診斷、分期及療效評價中應用廣泛，目前采用標準化攝取值(standardized uptake value, SUV)進行分析，但SUV是半定量指標，易受到注射時間、患者體質量、血糖水平等多種因素影響。全身動態18F-脫氧葡萄糖(fluorodeoxyglucose, FDG) PET/CT Patlak顯像具有傳統顯像無法獲得的FDG代謝的動力學信息，并且一次成像可生成多種類型PET圖像，如Patlak斜率Ki圖，Ki值代表FDG絕對攝取率，FDG絕對定量化有助于準確評估腫瘤治療效果，從而制定最佳治療方案以延長患者壽命[3-4]。本研究擬通過建立大鼠C6膠質瘤模型，采用齊墩果酸(oleanolic acid，OA)對其進行放射增敏治療，探討全身動態18F-FDG PET/CT Patlak顯像評價大鼠C6膠質瘤放療增敏早期療效的價值。

1 材料與方法

1.1 細胞株與實驗試劑大鼠C6膠質瘤細胞由安徽醫科大學基礎醫學院核醫學教研室提供；Dulbecco 改良 Eagle 培養基(dulbecco's modified eagle medium, DMEM)高糖培養基、胎牛血清、0.25%胰酶、磷酸鹽緩沖液均購自美國Gibco公司；齊墩果酸購自北京索萊寶科技有限公司；腫瘤增殖指數Ki-67及葡萄糖轉運蛋白-1(glucose transporter-1, GLUT-1)免疫組化試劑購自華安生物技術有限公司。

1.2 實驗動物24只雄性大鼠，SPF級，(4～5)周齡，體質量(170～230) g，購自浙江維通利華實驗動物技術有限公司，許可證編號：SCXK(浙)2019-0001；所有實驗動物方案均獲安徽醫科大學動物實驗倫理審查委員會批準，批號：LLSC20211059。

1.3 實驗儀器VitalBeam直線加速器購自美國瓦里安公司；Biograph Vision PET/CT購自德國Siemens公司；18F-FDG購自江蘇南京江原安迪科正電子研究發展有限公司，放化純度>95%。

1.4 細胞培養與大鼠C6膠質瘤模型建立大鼠C6膠質瘤細胞于37 ℃、5%CO2恒溫培養箱中培養，培養基為含10%胎牛血清的DMEM高糖培養基，隔天換液，通常傳至2～3代。取處于對數生長期的C6膠質瘤細胞，待細胞貼滿培養瓶底80%時用0.25%胰酶消化制成2.0×107/ml單細胞懸液，用1 ml無菌注射器抽取0.2 ml細胞懸液接種于大鼠右后肢皮下，記錄接種時間，約2周左右接種部位瘤體直徑≥1 cm時用于動物實驗。

1.5 實驗分組及處理將24只荷C6膠質瘤大鼠按隨機數字表法分為以下4組，每組6只：對照組，給予生理鹽水灌服，2 ml/d/只，共7 d；OA組，給予20 mg/ml的OA生理鹽水懸濁液灌服，2 ml/d/只，共7 d；單純放療組，采用美國VARIAN Vitalbeam醫用直線加速器進行放療，照射采用6 Mev電子線，照射野10 cm×10 cm，源皮距100 cm，劑量率2 Gy/min，分次照射劑量4 Gy，隔日1次，共3次，累計照射劑量12 Gy；OA+放療組，放療前7 d每日給予OA生理鹽水懸濁液灌服，劑量同OA組，7 d完成所有給藥，隨后使用與單純放療組相同的參數進行放射治療。

1.6 全身動態18F-FDG PET/CT Patlak顯像放療前及放療后48 h采用德國Siemens公司Biograph Vision PET/CT對四組荷C6膠質瘤大鼠行75 min全身動態18F-FDG PET/CT Patlak顯像，見圖1。大鼠顯像前夜禁食6 h，可自由飲水。用異氟烷麻醉大鼠并俯臥位固定于PET/CT檢查床上，先進行用于PET數據衰減校正的5 s低劑量CT采集(管電壓120 kV，管電流160 mA，螺距5.0 mm)，再移動檢查床于PET視野內，經大鼠尾靜脈彈丸式注射活度為37 MBq的18F-FDG，同時開始以心臟為中心的6 min動態單床PET采集，隨后在75 min內進行18次連續進床全身PET掃描。采集完成后，采用有序子集最大期望值法(order subsets expectation maximization，OSEM)對原始動態PET數據(共46幀圖)進行重建(參數：迭代4、子集5，矩陣為128×128)。在重建好的PET圖像中勾畫左心室感興趣體積(volume of interest， VOI)，并將勾畫好的左心室VOI復制映射到同一斷層所有幀中，生成左心室時間-活度曲線(tumor time activity curve，TAC)。左心室TAC曲線作為輸入函數用于Patlak模型分析并獲得Ki圖像，動態PET圖像最后一幀作為測量SUV的圖像用于靜態分析，在SUV圖像中勾畫每只荷瘤大鼠的腫瘤感興趣區域(region of interest，ROI)，并將ROI復制到Ki圖中，測量每只荷瘤大鼠右后肢腫瘤SUVmax及Ki值。4組荷瘤大鼠腫瘤體積由PET/CT系統自帶軟件True D計算測量。

圖1 全身動態18F-FDG PET/CT Patlak顯像流程圖

1.7 病理學檢查顯像完成后，迅速取出腫瘤組織，用體積分數4%多聚甲醛溶液固定，石蠟包埋，4 μm切片行Ki-67及GLUT-1免疫組織化學檢查。在高倍視野下(×400)，從每張切片隨機選擇5個視野進行拍照分析，計算每個視野100個細胞中的陽性細胞百分比。

2 結果

2.1 全身動態18F-FDG PET/CT Patlak顯像結果接種2周左右，24只大鼠右后肢均可見類圓形瘤體組織，接種成功率100%。18F-FDG PET/CT顯像荷瘤大鼠右后肢均可見不同程度放射性攝取增高灶，少數腫瘤放射性分布欠均勻。治療前，4組SUVmax、Ki值差異無統計學意義(FSUVmax=0.909，P>0.05；FKi=0.858，P>0.05)；治療后48 h，4組之間SUVmax、Ki值差異有統計學意義(FSUVmax=68.547，P<0.01；FKi=200.648，P<0.01)，對照組、OA組的SUVmax、Ki值較治療前升高(tSUVmax=-10.697，P<0.01、tKi=-17.516，P<0.01；tSUVmax=-19.321，P<0.01、tKi=-9.887，P<0.01)，放療組、OA+放療組的SUVmax、Ki值較治療前下降(tSUVmax=5.629，P<0.01、tKi=6.916，P<0.01；tSUVmax=7.241，P<0.01、tKi=10.490，P<0.01)。治療后放療組、OA+放療組的SUVmax差異無統計學意義(t=1.233，P=0.246)，而OA+放療組的Ki值較放療組降低，差異有統計學意義(t=3.051，P<0.05)，見表1、圖2。治療前4組腫瘤體積差異無統計學意義(F=0.507，P>0.05)。治療后48 h，4組腫瘤體積差異有統計學意義(F=432.386，P<0.01)，對照組、OA組腫瘤體積較治療前明顯增大，放療組、OA+放療組腫瘤體積增長緩慢，而放療組、OA+放療組腫瘤體積組間比較，差異無統計學意義(t=1.707，P>0.05)，見表1。

圖2 治療后48 h 4組大鼠全身動態18F-FDG PET/CT Patlak顯像圖A：對照組；B：OA組；C：單純放療組；D：OA+放療組

表1 各組大鼠治療前后腫瘤SUVmax、Ki值及腫瘤體積變化

2.2 免疫組化結果鏡下觀察，Ki-67陽性表達于細胞核，部分表達于細胞質中，4組陽性細胞百分比分別為(59.19±4.27)%、(60.14±5.24)%、(40.76±3.61)%和(31.77±3.87)%，OA+放療組陽性細胞百分比低于其他3組(F=63.887，t=11.657、10.662、4.161，P<0.05)，差異有統計學意義；GLUT-1陽性表達于細胞膜，部分表達于細胞質中，4組陽性細胞百分比分別為(74.53±5.66)%、(75.40±5.07)%、(53.21±9.11)%和(41.87±4.45)%，OA+放療組陽性細胞百分比顯著低于其他3組(F=40.720，t=11.116、12.173、2.743，P<0.05)，差異有統計學意義，見圖3。

圖3 各組荷C6膠質瘤大鼠腫瘤組織Ki-67及GLUT-1免疫組織化結果EnVision ×400

2.3 Ki-67及GLUT-1表達與Ki值之間的相關性分析Pearson相關分析結果顯示Ki-67及GLUT-1表達與Ki值均呈正相關(rKi-67=0.931，P<0.01;rGLUT-1=0.936，P<0.01)，見圖4。

圖4 Ki值與Ki-67及GLUT-1表達相關性分析A：Ki值與Ki-67表達相關分析圖；B：Ki值與GLUT-1表達相關分析圖

2.4 Kaplan-Meier法分析荷瘤鼠生存情況對照組、OA組、單純放療組、OA+放療組的生存時間分別為(43.00±7.97)天、(44.83±6.21)天、(52.00±3.10)天及(57.67±3.27)天，Kaplan-Meier法分析顯示各組間生存時間差異有統計學意義(χ2=19.817，P<0.01)，見圖5。

圖5 Kaplan-Meier法分析4組荷瘤鼠生存率

3 討論

惡性腫瘤的診斷及早期療效評價與患者預后密切相關，準確的療效評估對患者來說至關重要。PET/CT廣泛用于監測腫瘤組織代謝、增殖、乏氧及凋亡等情況，可特異性地從分子水平反映腫瘤治療效果[5]。在臨床實踐中，PET/CT檢查是將采集的數據在采集時間范圍內取平均值以生成傳統的靜態PET圖像，并以SUV為指標進行量化，然而SUV是對示蹤劑劑量及患者體重進行歸一化，并且很大程度上取決于注射示蹤劑至掃描的間隔時間，目前SUV仍存在很大的可變性[6]。

示蹤劑在組織中分布的動態過程可以反映關于組織代謝特性非常有用的信息，因此，本實驗引入了動態PET成像技術，允許隨著時間的推移掃描有限的軸向視野，并采用穩定的Patlak圖形分析法，從而提取重要的示蹤劑動力學參數，即攝取率Ki，它代表示蹤劑絕對代謝率，避免了時間依賴性，能夠對病灶進行更準確的分析[7]。

以前的研究主要集中關注PET/CT靜態顯像，而采用全身動態18F-FDG PET/CT Patlak顯像評估OA放射增敏早期療效的研究目前國內外尚未見報道。本實驗對大鼠C6膠質瘤行放射治療，使用放射增敏劑OA，采用全身動態18F-FDG PET/CT Patlak顯像評估OA對荷C6膠質瘤大鼠放療增敏的早期療效，觀察并記錄各組荷瘤鼠的生存時間。結果顯示，OA聯合放療可抑制腫瘤生長，延長荷瘤鼠的生存時間，然而，在治療后48 h，OA聯合放療組腫瘤體積較治療前并沒有縮小，且與放療組相比差異無統計學意義，這可能是由于治療后的腫瘤體積受到死細胞清除率、局部結構破壞及周圍組織水腫等多種因素的影響[8]，因此腫瘤體積并不是評價OA放射增敏早期療效的敏感指標。動態PET/CT Patlak顯像結果顯示，放療組和OA聯合放療組的SUVmax及Ki值較放療前均下降，說明放療后，腫瘤細胞活性受到抑制，因此腫瘤病灶的放射性攝取下降，而兩組的SUVmax組間差異無統計學意義，但是兩組的Ki值組間統計學差異顯著，說明全身動態18F-FDG PET/CT Patlak顯像在檢測OA治療后腫瘤活性早期變化方面比傳統PET/CT靜態顯像更敏感。

Ki-67是目前廣泛應用的一種細胞增殖標志物，表達于細胞周期的S、G1、G2、M期，G0期不表達，Ki-67表達與細胞增殖活性密切相關，可以反映腫瘤細胞增殖及預后情況[9-10]。Glut-1是葡萄糖轉運蛋白家族中的一種，是細胞攝取葡萄糖的主要載體，可促進葡萄糖轉運，腫瘤細胞由于無氧酵解水平的增加，導致Glut-1在惡性腫瘤細胞中有更高水平的表達[11]。本實驗中，放療組與OA聯合放療組中Ki-67及Glut-1的表達低于對照組，而OA聯合放療組的表達更低，提示放射治療后，腫瘤細胞的增殖活性及代謝活性均降低，而使用放射增敏劑的OA聯合放療組對放射治療更敏感。此外，本研究將全身動態PET/CT結果與免疫組化結果進行相關性分析，發現動態PET/CT Ki值與Ki-67及Glut-1表達呈明顯正相關，進一步驗證了全身動態18F-FDG PET/CT Patlak顯像可以反映OA治療后腫瘤細胞增殖活性及代謝活性的早期變化。

綜上所述，OA對大鼠C6膠質瘤有放射增敏作用，全身動態18F-FDG PET/CT Patlak顯像可以通過反映腫瘤細胞增殖活性及代謝活性的早期變化，評估大鼠C6膠質瘤放療增敏的早期療效，比傳統PET/CT靜態顯像更靈敏。