組織蛋白酶L激活PKC信號加重TCE致敏小鼠腎臟損害

王燚燦，洪依婷，黃 猛，張家祥，王 峰，彭家樂，朱啟星,3

職業暴露于三氯乙烯(trichloroethylene，TCE)的部分工人可出現類似于重癥藥疹樣的皮膚黏膜損害，伴肝臟和腎臟等多臟器功能紊亂，在我國被定義為三氯乙烯藥疹樣皮炎(occupational medicamentosa-like dermatitis due to trichloroethylene，OMDT)[1-2]。盡管OMDT的發病率低，但其病死率可高達8.6%[3]。長期的糖皮質激素治療導致患者出現多種并發癥，嚴重影響患者預后[4]。腎臟損害是加重患者病情、影響預后的主要因素[5]，然而目前關于OMDT腎臟損傷的內在機制尚不明確。

前期研究[6-7]表明，TCE致敏陽性小鼠同時存在腎小球和腎小管的結構和功能損害。近年來，大量研究[8-9]表明組織蛋白酶L(cathepsin L，CTSL)廣泛參與多種腎臟疾病的發病過程，有望成為腎臟疾病治療的新靶點。CTSL是半胱氨酸蛋白酶家族成員，在一定刺激下從溶酶體釋放出，介導細胞死亡和蛋白質降解等生物學過程。研究[6]表明TCE致敏小鼠受損的足細胞中存在CTSL的過表達，藥理學抑制CTSL的過表達可有效改善腎臟損害情況，但是其具體作用機制尚不明確。蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)是組織蛋白酶的重要底物之一，可介導炎癥和凋亡等生物過程[10]。該研究旨在探討CTSL介導TCE致敏小鼠腎臟損傷的分子機制。

1 材料與方法

1.1 主要材料三氯乙烯(分析純，貨號：251402)、弗氏完全佐劑(FCA，貨號：F5881)在美國Sigma公司購買；蘇木精染液(貨號：ZLI-9610)、伊紅(貨號：ZLI-9613)在北京中杉金橋生物公司購買；RIPA 裂解液(貨號：P0013B)、苯甲基磺酰氟(PMSF，貨號：ST505)、BCA蛋白濃度檢測試劑盒(貨號：P0012)和5X 蛋白上樣緩沖液(貨號：P0015L)在上海碧云天生物技術有限公司購買；4%多聚甲醛(貨號：BL539A)和二抗(貨號：BL003A,BL001A)在美國Biosharp公司購買；ECL發光液(貨號：K-12045-D50)在美國Advansta公司購買；TUNEL染色試劑盒(貨號：11772465001)在美國Roche公司購買；尿素氮(BUN，貨號：C013-2-1)測定試劑盒購自南京建成生物工程研究所；在 CTSL(貨號：sc-390385)、PKC(貨號：sc-17804)、p-PKC(貨號：sc-377565)的鼠單克隆抗體和CTSL抑制劑(貨號：sc-364671)在美國Santa公司購買；β-actin單克隆抗體(貨號：8457s)在美國CST公司購買，驢抗鼠IgG熒光二抗(貨號：ab150108)在美國abcam公司購買。

1.2 實驗動物分組與模型建立在安徽醫科大學實驗動物中心購買SPF級雌性BALB/c小鼠41只，6～8 周齡，體質量(16～18)g。待適應性飼養7天后隨機將小鼠分為空白對照組5只、溶劑對照組5只、TCE處理組15只以及TCE+CTSLi處理組16只。空白對照組不做任何處理；溶劑對照組小鼠使用不含TCE的相同比例丙酮和橄欖油的混合溶液，其余處理與TCE處理組相同；TCE小鼠致敏模型按既往建模方法進行建立[11]：對小鼠背部剃毛，實驗第1天對TCE處理組和TCE+CTSLi處理組小鼠進行皮下注射100 μl的50% TCE 溶液與等量FCA的混合液，在第4、7、10 天背部涂抹100 μl 50%的TCE 溶液，最后在第17、19 天對小鼠皮膚涂抹100 μl的30%TCE溶液分別進行初次和末次激發。TCE+CTSLi處理組在初末激發2 h前進行腹腔注射10 mg/kg劑量的CTSL抑制劑。末次激發24 h后進行小鼠皮膚致敏評分，末次激發72 h后，麻醉、處死小鼠，無菌取腎臟組織，用于組織病理學和相關蛋白的水平檢測。

1.3 皮膚致敏反應視覺評分于末次激發24 h后，對小鼠的皮膚表現進行評分。具體評分標準為：① 0分：無反應；② 1分：散在或小塊紅斑；③ 2分：中度彌漫的紅斑、輕微水腫；④ 3分：嚴重紅斑、水腫。根據評分≥1分即評為致敏陽性組，反之評為致敏陰性組，即將TCE處理組和TCE+CTSLi處理組分為TCE致敏陽性組、TCE+CTSLi致敏陰性組、TCE+CTSLi致敏陽性組和TCE+CTSLi致敏陰性組。

1.4 免疫熒光將腎臟組織進行烤片，脫蠟，過碘酸阻斷過氧化物酶(HRP)孵育20 min，PBS洗滌3次，枸櫞酸抗原修復15 min，洗滌，0.5% Triton X-100在PBS中通透切片30 min，洗滌。血清封閉2 h，CTSL一抗(稀釋比1 ∶400)于4 ℃過夜，24 h后，切片恢復至室溫后，PBS洗滌后二抗(稀釋比1 ∶1 000)避光孵育2 h，DAPI染核15 min，封片并拍照。

1.5 小鼠腎臟病理學檢查取部分新鮮小鼠腎臟組織固定于4%多聚甲醛3 d，石蠟包埋制備腎臟組織蠟塊，切片厚度為0.4 μm，以進行常規HE染色，顯微鏡觀察組織病理學改變。

取新鮮小鼠腎皮質在2.5%戊二醛和1%鋨酸中固定10 h后，按標準化制備程序制成標本，透射電鏡觀察腎細胞超微結構。

1.6 TUNEL染色TUNEL染色按照試劑盒說明書進行，蛋白酶K穿孔后，腎臟切片用TUNEL反應混合物在37 ℃孵育30 min，然后用DAB顯色，顯微鏡拍照，Image J軟件計算凋亡細胞率。

1.6 Western blot檢測PKC、p-PKC蛋白表達水平新鮮腎臟組織在RIPA裂解液勻漿裂解后，提取總蛋白，并測定蛋白濃度。12.5% SDS-PAGE凝膠電泳結束后，200 mA恒流濕轉3 h；PVDF膜在5%脫脂牛奶中室溫封閉2 h，將膜與針對PKC(稀釋比1 ∶1 000)、p-PKC(稀釋比1 ∶1 000)和β-actin(稀釋比1 ∶10 000)的抗體于4 ℃孵育過夜。第2天，PBST洗膜3次，10 min/次，二抗(稀釋比1 ∶10 000)室溫孵育2 h后，重復洗膜，化學發光儀顯影，Image-Pro Plus software6.0軟件分析條帶光密度值。

2 結果

2.1 小鼠皮膚致敏情況與腎臟病理學改變情況根據皮膚致敏反應對小鼠進行評分，具體如下：空白組與溶劑組小鼠背部均未見明顯水腫和紅斑，致敏評分均為0。TCE處理組致敏率為53.3%(8/15)，其中評為1分的4只，評為2分的4只。TCE+CTSLi處理組致敏率為50.0%(8/16)，其中評為1分的4只，評為2分的4只。且兩組間小鼠致敏率無統計學差異(P>0.05)。

HE染色結果顯示，空白對照組、溶劑對照組、TCE致敏陰性組和TCE+CTSLi致敏陰性組小鼠的腎小球與腎小管結構完整，未見明顯病理學損傷。與溶劑對照組相比，TCE致敏陽性組小鼠的腎小管上皮細胞出現明顯細胞水腫、空泡變性等。而TCE+CTSLi致敏陽性組小鼠較TCE致敏陽性組小鼠腎臟上述損傷減輕。經檢測小鼠血清BUN水平發現，與其他組相比，TCE致敏陽性組(25.268±5.680)和TCE+CTSLi致敏陽性組(17.365±2.265)小鼠血清中的BUN水平升高，而TCE+CTSLi致敏陽性組較TCE致敏陽性組BUN的水平有一定程度下降，差異均有統計學意義(P<0.05,F=18.283)；其他組BUN水平相對較低，差異無統計學意義(P>0.05)，見圖2。

圖1 各組小鼠腎臟病理改變情況 HE染色 ×400 圖2 各組小鼠血清BUN水平

2.2 CTSL過表達對TCE致敏小鼠腎臟損害的影響本次研究結果發現CTSL在TCE致敏陽性組小鼠腎臟尤其在腎小球上高表達，見圖3。電鏡結果顯示，TCE致敏陽性組小鼠腎小球濾過膜結構遭到破壞，基底膜增厚，且厚度不均，足細胞足突結構受損，出現融合、消失，線粒體水腫和空泡樣變性，見圖4。與TCE致敏陽性組相比，TCE+CTSLi致敏陽性組小鼠CTSL表達水平降低(P<0.05，F=82.438)、腎小球基底膜損傷程度減輕。

圖3 不同組別小鼠腎臟CTSL表達情況

圖4 不同組別小鼠腎臟形態學改變情況電鏡 ×30 000

2.3 CTSL誘導TCE致敏小鼠腎臟結構細胞凋亡通過TUNEL染色評估CTSL誘導細胞凋亡的情況。結果顯示：與空白對照組相比，溶劑對照組、TCE致敏陰性組、TCE+CTSLi致敏陰性組小鼠腎小球結構細胞凋亡比例未見明顯異常，差異無統計學意義(P>0.05)；與TCE致敏陰性組相比，TCE致敏陽性組小鼠腎小球凋亡細胞比例升高，差異有統計學意義(P<0.05)；與TCE致敏陽性組相比，TCE+CTSLi致敏組小鼠腎小球凋亡細胞比例下降，差異有統計學意義(P<0.05)。不僅如此，腎小管細胞凋亡情況與腎小球相似，TCE致敏陽性組小鼠腎小管凋亡細胞比例高于其他各組(P<0.05)，而TCE+CTSLi致敏陽性組小鼠腎小管凋亡細胞比例低于TCE致敏陽性組，見圖5。以上結果說明，CTSL可以通過同時誘導腎小球和腎小管細胞凋亡，加重TCE致敏小鼠腎結構損害。

圖5 不同組別小鼠腎臟結構細胞凋亡情況TUNEL染色 ×1 000

2.4 CTSL激活TCE致敏小鼠腎臟PKC信號分子Western blot檢測結果表明,空白對照組、溶劑對照組、TCE致敏陰性組和TCE+CTSLi致敏陰性組中p-PKC蛋白的相對表達水平差異無統計學意義(P>0.05)。與其他各組相比，TCE致敏陽性組和TCE+CTSLi致敏陽性組的p-PKC的蛋白表達水平升高(P<0.05)。與TCE致敏組相比，TCE+CTSLi致敏陽性組p-PKC蛋白相對表達有所下降，差異有統計學意義(P<0.05,F=35.686)，見圖6。

3 討論

作為OMDT常見并發癥之一，TCE誘導的腎臟損害不僅會增加患者的治療難度，而且嚴重影響患者預后[5,12]。近年來，多項研究[8-9]提示CTSL在多種自身免疫性腎臟疾病中發揮著關鍵作用。本研究表明藥理學抑制TCE致敏陽性小鼠腎臟CTSL的過表達后，腎臟損傷減輕，提示CTSL有望成為OMDT腎臟損害臨床治療的潛在作用靶點。本課題組既往研究提示CTSL可能是TCE致敏所致腎小球損傷重要參與者，本次研究結果進一步顯示，在TCE致敏陽性小鼠中腎臟過表達的CTSL與腎小球凋亡細胞水平呈正相關，抑制CTSL表達后，腎小球凋亡水平降低，提示過表達的CTSL可能是腎臟結構細胞凋亡的重要誘因之一。盡管病理學結果顯示致敏陽性小鼠腎小球細胞的損害，然而過表達的CTSL是否破壞腎小球屏障結構還有待探究。

圖6 不同組別小鼠腎臟PKC、p-PKC蛋白表達

雖然本研究發現CTSL主要表達于TCE致敏小鼠受損的腎小球，但是通過藥理學抑制CTSL的表達后， TCE致敏所致的腎小管損傷同樣有所減輕。課題組推測，CTSL可能是TCE致敏所致腎損傷中腎小球和腎小管對話的一個關鍵作用環節。腎小球-腎小管之間存在廣泛的生物信息聯系，存在許多共同的信號通路的參與，其串擾逐漸引起了廣泛關注。由于球-管的特殊生理結構，腎小球分泌的包括血管內皮細胞生長因子、血管生成素-1、炎癥因子在內的多種生物信息因子可通過旁分泌等途徑作用于腎小管上皮細胞，導致其結構和功能發生不同程度的改變[13]。另一方面，腎小管炎癥反應同樣可以反過來損害腎小球的濾過功能，導致腎功能的下降。腎小球-腎小管的這種交互作用于信息傳遞在維系正常腎臟結構和功能中發揮重要作用，這種正常的生物信息傳遞的破壞也是多種腎臟疾病發病的分子機制。

慢性腎病的體外研究[14]表明細胞內白蛋白的超載可誘導內質網應激和激活PKC/p38 MAPK通路，介導足細胞凋亡。此外，PKC還是導致蛋白尿形成的關鍵分子，尿蛋白等生物大分子的過度運輸不僅可加重腎小管負載，還可加重腎小管間質炎性損傷以及誘導RTECs凋亡。研究[15]顯示藥理學抑制PKC過表達可通過降低蛋白尿的生成，從而減輕腎小管負載和腎小管細胞凋亡的發生。本課題組前期研究[16]表明CTSL可通過切割補體C3，同時還可激活p38 MAPK和NF-κB通路。由此可見，PKC信號在串聯腎小球-腎小管結構和功能中發揮關鍵作用。本研究中，蛋白免疫印跡結果顯示TCE致敏陽性小鼠腎臟中PKC磷酸化水平明顯升高，而CTSLi的預處理降低其表達。因此，推測在TCE致敏腎損害過程中，PKC可能是CTSL介導TCE所致腎小球和腎小管的損害過程中的一個關鍵作用分子。

綜上所述，在TCE致敏過程中，過表達的CTSL可以通過激活PKC信號通路，誘導腎小球細胞和腎小管細胞凋亡，介導腎臟損害。藥理性抑制CTSL的過表達可以明顯改善TCE致敏所致小鼠腎臟損害，有望成為治療OMDT腎臟損傷的潛在靶點之一。