基于miR-15a-5p/P53信號通路探討EMT與肺癌細胞阿霉素耐藥的關(guān)系

魏 東，辛運超，劉 博，容 宇，李彥明，郝雁冰

非小細胞肺癌是全世界人類腫瘤相關(guān)死亡的主要原因，5年生存率<15%[1]。單純化療或聯(lián)合放療為治療晚期肺癌的一線治療策略[2]。然而，由于固有的或獲得性的耐藥性，化療的療效是短暫的，并且受到顯著地限制，從而導(dǎo)致較差的生存率[3]。阿霉素(doxorubicin，DOX)已被用于肺癌的治療。然而，DOX耐藥性限制了其臨床療效[4]。更好地理解揭示化療耐藥(包括DOX耐藥)的分子機制對于肺癌患者獲得更好的生存率非常重要。MicroRNAs(miRNAs)是一種小的非編碼RNA，通過與靶向mRNAs的3′非翻譯區(qū)(3′-UTR)結(jié)合調(diào)節(jié)基因表達[5]。miRNA在肺癌進展過程中的異常表達與細胞增殖、侵襲、遷移和化療耐藥密切相關(guān)[6]。據(jù)報道，miR-15a-5p作為一種腫瘤抑制因子，在胃癌、甲狀腺乳頭狀癌和前列腺癌中表達下調(diào)[7]。最近，miR-15a-5p被報道通過抑制組蛋白乙酰化抑制肺癌轉(zhuǎn)移和脂質(zhì)代謝[8]。在多發(fā)性骨髓瘤中，miR-15a-5p參與了外泌體相關(guān)miRNAs耐藥性[9]。盡管miR-15a-5p參與了腫瘤生長過程中的化療耐藥，但其對肺癌DOX耐藥的作用尚不清楚。該研究探討了miR-15a-5p在肺癌細胞對DOX耐藥中的作用，并闡明其與DOX耐藥之間的功能和機制聯(lián)系。

1 材料與方法

1.1 細胞與培養(yǎng)人肺癌細胞系A(chǔ)549購自美國ATCC公司，將細胞培養(yǎng)在含有10%胎牛血清(FBS，美國Hyclone公司)、100單位/ml青霉素和100 mg/ml鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基(美國Gibco公司)。A549/DOX抗性細胞(A549/D)購自武漢普諾賽生命科技有限公司。A549/D是通過在DMEM中逐漸提高DOX濃度(0.01 mg/L～1 mg/L)來篩選出具有抗藥性的細胞，將A549/D細胞連續(xù)暴露于DOX(1 mg/L)下，維持細胞的耐藥性。

1.2 體外轉(zhuǎn)染廣州銳博生物技術(shù)有限公司合成miR-15a-5p模擬物、siRNA敲低miR-15a-5p(si-miR-15a-5p)及其相應(yīng)的陰性對照(NC)寡核苷酸。使用Lipofectamine 3000(美國Invitrogen公司)進行所有轉(zhuǎn)染。

1.3 細胞活力分析將轉(zhuǎn)染處理后的細胞(1×104個/孔)接種到96孔培養(yǎng)板中。孵育4 h后，向每個孔中加入10 μl MTT溶液(美國Sigma公司)，繼續(xù)孵育4 h。離心，吸出含有MTT的培養(yǎng)基，然后加入100 μl DMSO。用Mithras2LB943全功能微孔板分析儀(美國Berthold Technologies公司)在490 nm下測量每個孔的光密度。未經(jīng)處理的細胞作為對照。細胞存活率(%)=吸光度處理組/吸光度對照組×100。細胞毒性表現(xiàn)為DOX抑制50%細胞生長的濃度(IC50)。

1.4 細胞凋亡測定收集處理后細胞并用PBS洗滌2次，使用FITC Annexin V凋亡檢測試劑盒I(美國BD Biosciences公司)對細胞進行雙重染色。然后，用流式細胞儀(美國BD Biosciences公司)分析標記細胞。

1.5 蛋白質(zhì)印跡分析用蛋白裂解緩沖液(南京Beyotime公司)從細胞中提取總蛋白。裂解物在十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)前變性，然后轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(美國Millipore公司)。然后，在室溫下用5%脫脂牛奶封閉膜1.5 h，在4 ℃下與一級抗體孵育過夜。接下來，用二級抗體(南京Beyotime公司)進一步孵育細胞膜1 h。最后用增強化學(xué)發(fā)光試劑(ECL，美國Pierce公司)觀察免疫反應(yīng)信號。研究中使用的主要抗體如下：抗波形蛋白(美國Abcam公司)、抗E-鈣粘蛋白及抗N-鈣粘蛋白(美國ThermoFisher Scientific公司)、抗P53(Abcam)和抗GAPDH(Abcam)。

1.6 實時定量PCR(RT-qPCR)分析使用RNAeasy迷你試劑盒(美國Qiagen公司)從培養(yǎng)細胞中提取總RNA，并使用高容量逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國Applied Biosystems公司)進行逆轉(zhuǎn)錄。然后，在ABI7900HT實時PCR系統(tǒng)(Applied Biosystems)上使用GoTaq qPCR Master Mix(美國Promega公司)進行qPCR分析。所有結(jié)果均采用2-ΔΔCt法進行分析。miRNA表達水平標準化為U6。U6和miR-15a-5p的引物購自上海捷瑞生物工程有限公司。用于qPCR的引物序列如下：miR-15a-5p(正向)5′-ACACTCCAGCTGGGAAACCGTTACCATTAC-3′，(反向)5′-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAG TTGAGCTTACA-3′；U6(正向)5′-GCTTCGGCAC ATATACTA-3′，(反向)5′-AACGCTTCAATTTGC-3′。

1.7 生物信息學(xué)預(yù)測與雙熒光素酶報告子分析在熒光素酶報告實驗中，用PCR方法從人基因組DNA中擴增出含有miR-15a-5p結(jié)合序列的P53基因3′UTR片段的野生型(WT)。為了檢測miR-15a-5p是否調(diào)控P53的表達，研究合成了含有miR-15a-5p靶結(jié)合位點的野生型P53及其突變體，并將其插入pGL3熒光素酶載體(美國Promega Corporation公司)的3′UTR中。然后用Lipofectamine 3000將WT或突變型(MT)pGL3-P53-3′UTR與miR-NC、miR-15a-5p、抗miR-NC或抗miR-15a-5p聯(lián)合轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后24 h收獲細胞，使用雙熒光素酶報告試劑盒(美國Promega Corporation公司)測量熒光素酶活性，并與Renilla熒光素酶活性進行標準化。

1.8 裸鼠移植瘤共24只雌雄各半BALA/C裸鼠(年齡4～6周；體質(zhì)量：18～24 g；上海杰思捷實驗動物有限公司，生產(chǎn)許可證：[SCXK(滬)2018-0004]，小鼠左側(cè)皮下注射A549/D細胞(5×106)。腫瘤體積達到50 mm3后，將小鼠隨機分為4組：①PBS組；②DOX組(2 mg/kg，每2 d 1次)；③ miR-15a-5p agomir組(小鼠2 nmol/只，每3 d 1次)，或④ DOX聯(lián)合miR-15a-5p agomir組。miR-15a-5p agomir由miR-15a-5p模擬物化學(xué)修飾而成。每3 d用游標卡尺測量一次腫瘤大小，用游標卡尺測量腫瘤結(jié)節(jié)最大軸徑(A)和最小軸徑(B)，腫瘤體積(TV)=(A×B2)/2。第30天，對裸鼠進行安樂死和解剖。每組取3個腫瘤組織作石蠟切片。

1.9 免疫組織化學(xué)染色腫瘤組織用4%福爾馬林固定，石蠟包埋。組織切片(4 μm厚)在二甲苯中脫蠟，在一系列分級乙醇中再水化，并通過煮沸回收抗原。用10%山羊血清(北京Solarbio公司)阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性30 min，并與兔抗鼠P53(1 ∶1 000；美國Abcam公司)在4 ℃下孵育過夜。第二天，切片在室溫下與山羊抗兔IgG(1 ∶100；美國Abcam公司)孵育30 min，然后與HRP標記的鏈霉親和素反應(yīng)30 min。最后，用3,3′-二氨基聯(lián)苯胺溶液(DAB，Solarbio)顯影切片，蘇木精復(fù)染后，用中性香脂密封，在光學(xué)顯微鏡下觀察切片。

2 結(jié)果

2.1 miR-15a-5p的過度表達使肺癌細胞對DOX治療敏感MTT分析顯示，A549/D對DOX處理表現(xiàn)出最高的活性(IC50值：8.63±0.26 μmol/L)，而A549細胞表現(xiàn)出最低的細胞活性(IC50值：0.77±0.08 μmol/L)(圖1A)。為了探討miR-15a-5p在肺癌細胞化療耐藥中的作用，檢測了miR-15a-5p在有無耐藥的肺癌細胞中的表達。如圖1B所示，與A549細胞相比，A549/D細胞中miR-15a-5p的表達降低。然后，在A549/D細胞中增強miR-15a-5p的表達，并降低其在A549細胞中的表達，用RT-qPCR證實轉(zhuǎn)染效率(圖1C、D)。采用MTT法檢測不同劑量DOX處理24 h后si-miR-15a-5p轉(zhuǎn)染的A549細胞和miR-15a-5p模擬物轉(zhuǎn)染的A549/D細胞的存活率情況，miR-15a-5p的敲低提高了A549細胞的細胞活力(IC50值：8.86±0.32 μmol/L)，miR-15a-5p的過表達降低了A549/D細胞的細胞活力(IC50值：1.92±0.11 μmol/L)(圖1E、F)。為了確定miR-15a-5p是否調(diào)節(jié)細胞凋亡，對肺癌細胞進行了流式細胞術(shù)分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在A549細胞中干擾miR-15a-5p表達減少凋亡(t=29.406，P<0.001)，在A549/D細胞中增加miR-15a-5p表達促進凋亡(t=36.281，P<0.001)(圖1G、H)。

圖1 miR-15a-5p的過度表達使肺癌細胞對DOX治療敏感

2.2 miR-15a-5p調(diào)控肺癌細胞的上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelialmesenchymal transition，EMT)研究進一步考察了EMT是否與肺癌細胞中miR-15a-5p調(diào)節(jié)的DOX敏感性有關(guān)。如圖2A所示，DOX處理使A549細胞中的N-鈣粘蛋白和波形蛋白表達水平降低，而E-鈣粘蛋白上調(diào)，表明肺癌細胞中的EMT降低。同時，DOX誘導(dǎo)A549細胞中miR-15a-5p表達水平增加(圖2B)。通過轉(zhuǎn)染si-miR-15a-5p逆轉(zhuǎn)了DOX對EMT的抑制作用(圖2C)。

2.3 miR-15a-5p與P53結(jié)合為了探索miR-15a-5p調(diào)節(jié)A549細胞化療敏感性的機制，利用預(yù)測算法，包括TargetScan、starbase、exiqon和miRDB來識別miR-15a-5p的潛在靶基因。生物學(xué)預(yù)測結(jié)果證明P53和miR-15a-5p之間存在特異性結(jié)合位點(圖3A-B)。為了證實miR-15a-5p是否能直接靶向P53，在A549和A549/D細胞中構(gòu)建了含有P53 3’UTR結(jié)合位點WT或MT的載體。如圖3C和D所示，在A549細胞中，下調(diào)miR-15a-5p降低WT P53報告基因的熒光素酶活性，而在A549/D細胞中，過表達miR-15a-5p提高WT P53報告基因的熒光素酶活性。然而，在A549和A549/D細胞中，突變的MT P53組均未觀察到這些作用，提示P53是miR-142-3p的靶基因。隨后進行Western blot檢測P53蛋白水平。如圖3E和F所示，在A549細胞中干擾表達miR-15a-5p減少P53蛋白表達(P<0.001)，在A549/D細胞中增加miR-15a-5p表達增加P53蛋白表達(P<0.01)。

圖3 miR-15a-5p通過結(jié)合P53的3’UTR促進P53表達

2.4 miR-15a-5p過表達促進DOX的體內(nèi)抗腫瘤作用通過體內(nèi)實驗進一步研究miR-15a-5p對DOX抗性的影響。如圖4A、B所示，miR-15a-5p agomir聯(lián)合DOX可降低腫瘤體積。免疫組化染色顯示，與miR-15a-5p agomir和DOX聯(lián)合治療的小鼠腫瘤切片中P53增加(圖4C)。Western blot結(jié)果顯示，DOX和miR-15a-5p agomir聯(lián)合治療降低了腫瘤樣本中N-cadherin的表達水平，同時增強了P53、E-cadherin蛋白的表達水平(圖4D)。總之，這些結(jié)果表明miR-15a-5p的過度表達促進了肺癌治療的藥物敏感性。

圖4 miR-15a-5p的過度表達促進了DOX在體內(nèi)的抗腫瘤作用(n=6)

3 討論

盡管DOX的應(yīng)用提高了肺癌患者的生存率，但其耐藥性限制了其廣泛應(yīng)用，導(dǎo)致治療失敗[4]。對化療的治療抵抗是肺癌和其他癌癥患者面臨的全球性健康挑戰(zhàn)。大量的研究工作已經(jīng)被引導(dǎo)到尋找潛在的驅(qū)動基因和預(yù)測治療反應(yīng)和確定替代治療。在肺癌的發(fā)展過程中，miRNA的異常表達是常見的，這也與化療耐藥有關(guān)[3]。然而，miRNAs的調(diào)控作用相當復(fù)雜，其對肺癌耐藥的影響尚不清楚。miR-15a-5p被認為在不同類型的癌癥中發(fā)揮抑癌作用，如前列腺癌、胃癌和黑色素瘤等[8-9]。因此，miR-15a-5p有望成為腫瘤治療的靶點。本研究發(fā)現(xiàn)A549/D細胞中miR-15a-5p的表達低于A549細胞，并且miR-15a-5p增強了肺癌細胞對DOX的敏感性，減少了A549細胞的增殖，促進了A549細胞的凋亡。這些結(jié)果表明miR-15a-5p是肺癌進展過程中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。此外，熒光素酶活性測定顯示，miR-15a-5p的過度表達通過結(jié)合與種子區(qū)互補的3′UTR基序促進P53的表達。這些發(fā)現(xiàn)提示miR-15a-5p可能作為一個潛在的生物標志物來預(yù)測患者對DOX化療的反應(yīng)。

越來越多的研究表明，EMT是上皮細胞向間充質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化的生物學(xué)過程。EMT在調(diào)節(jié)腫瘤發(fā)病機制中起著重要作用[10]。EMT激活在包括肺癌在內(nèi)的各種類型腫瘤的進展過程發(fā)揮重要作用[10]。異常EMT促使癌細胞具有高度惡性的特性，包括侵襲、遷移以及遠處轉(zhuǎn)移[10]。此外，大量研究表明，EMT有助于腫瘤細胞化療耐藥的發(fā)展[11]。最近的證據(jù)表明，miR-200a、miR-200b、miR-429、miR-200c和miR-141等miRNAs可以抑制ZEB1/2和β-catenin來中斷EMT信號[12]。相反，miR-221和miR-222靶向TRPS1，導(dǎo)致E-鈣粘蛋白表達減少，從而促進EMT[13]。在本研究中，miR-15a-5p的過表達降低了波形蛋白和N-鈣粘蛋白的表達，增加了E-鈣粘蛋白的表達，提示miR-15a-5p通過介導(dǎo)EMT抑制肺癌細胞的DOX抵抗。

生物信息學(xué)分析證實P53是肺癌細胞中miR-15a-5p的一個靶基因。研究結(jié)果表明miR-15a-5p敲除導(dǎo)致肺癌細胞P53減少，而miR-15a-5p過表達導(dǎo)致P53增加。腫瘤蛋白P53是目前研究最多的抑癌基因之一。P53通過誘導(dǎo)細胞周期阻滯、DNA修復(fù)或凋亡來抑制腫瘤的形成并保護DNA免受損傷[14]。P53的抑制被證明與肺癌患者的耐藥性和預(yù)后有關(guān)，增加P53表達可提高肺癌細胞對順鉑治療的敏感性[14]。因此，P53是調(diào)控肺癌細胞化療耐藥的關(guān)鍵分子。最近的研究表明，miR-125b、miR-504、miR-25和miR-30d等miRNAs可以調(diào)節(jié)P53的豐度和活性，并對P53產(chǎn)生負性調(diào)節(jié)[15]。因此，推測P53可能參與miR-15a-5p介導(dǎo)的DOX耐藥。為此，研究首先檢測了miR-15a-5p對A549和A549/D細胞P53表達的影響。結(jié)果顯示，在A549細胞中阻斷miR-15a-5p減少P53蛋白表達，A549/D細胞中miR-15a-5p過表達增加了P53蛋白水平。此外，通過體內(nèi)實驗證實P53是miR-15a-5p的一個功能性靶基因，參與調(diào)控肺癌的DOX抗性。這些發(fā)現(xiàn)支持miR-15a-5p在肺癌化療耐藥中調(diào)節(jié)P53通路的主要作用。