胸腔積液游離核酸檢測在結核性胸膜炎早期診斷中的價值

張蕓 李琨 梁清濤 劉子臣 段鴻飛 李雪蓮 郭茹 車南穎 楊新婷

結核性胸膜炎是結核分枝桿菌及其代謝產物進入胸膜腔引起的胸膜炎癥反應［1］。結核性胸膜炎多見于青年男性，最常見的臨床表現是發熱、胸疼、咳嗽及活動后呼吸困難［2］。《WS 288—2017 肺結核診斷》［3］中明確提出胸腔積液查到結核分枝桿菌或其核酸檢測陽性是結核性胸膜炎確診的依據。由于結核性胸膜炎胸腔積液含菌量少的特點，結核性胸膜炎患者胸腔積液中查到抗酸桿菌的陽性率不足5%，分枝桿菌培養陽性率也僅為30%，而且培養仍需4～8周時間［4-5］。世界衛生組織（World Health Organization，WHO）推薦診斷結核病的檢測方法GeneXpert MTB/RIF陽性率也僅有34%～51%［6-7］。而臨床上常用的生化檢測指標，例如腺苷脫氨酶（adenosine deaminase，ADA）和結核感染T細胞斑點試驗（T-SPOT.TB），雖敏感度較高，但其特異度較差［8-9］。閉式胸膜活檢和內科胸腔鏡雖能通過獲取胸膜組織使結核性胸膜炎診斷率提高至85%以上，但因其為有創檢查，難以在臨床廣泛應用［10-11］。因此，臨床迫切需要更靈敏快速的病原學診斷技術應用于結核性胸膜炎的早期確診。

游離核酸（cell-free DNA，cf-DNA）是存在于生物體液中無細胞狀態的胞外DNA 片段，可存在于機體任何體液中［12］。cf-DNA 作為新的生物標志物，最早應用于產前胎兒排除畸形檢查中。隨后該技術被廣泛用于自身免疫疾病和腫瘤的治療、預后、復發等相關領域［13］。最近研究發現，血漿cf-DNA也存在引起機體不同部位感染的多種細菌、真菌和寄生蟲等病原體基因組DNA 片段，顯示其可能成為診斷感染性疾病的新技術［14-15］。隨著對結核分枝桿菌認識的加深，人們了解到該菌在正常代謝、凋亡或被破壞后可釋放其特異cf-DNA 片段IS6110。IS6110不僅在結核分枝桿菌復合群中拷貝數多、降解迅速，而且可通過PCR 技術被檢測到［16-17］。因此，筆者推測通過檢測胸腔積液結核分枝桿菌游離核酸（cell-freeMycobacterium tuberculosisDNA test，CF.TB）可能會更敏感和特異地診斷結核性胸膜炎。筆者前期在小樣本的臨床試驗中證實了結核性胸膜炎患者胸腔積液中不僅能檢測到IS6110，而且CF.TB 檢測可用于結核性胸膜炎的早期診斷［18］。但此技術診斷結核性胸膜炎的敏感度是否優于臨床上常用的生化指標和傳統核酸擴增技術（nucleic acid amplification test，NAAT）尚缺乏臨床觀察數據。筆者擬通過對2016年7月至2018年12月連續住院的不明原因胸腔積液患者同時行胸腔積液CF.TB、RNA 恒溫擴增實時檢測技術（simultaneous amplification and testing，SAT-PCR）、GeneXpert MTB/RIF、ADA 及血T-SPOT.TB 檢測，評價CF.TB對結核性胸膜炎早期診斷的價值，同時探討CF.TB技術單獨或聯合ADA 對臨床表現不典型的結核性胸膜炎早期診斷價值，為臨床推廣提供循證醫學依據。

對象和方法

一、研究對象

選擇2016年7月至2018年12月首都醫科大學附屬北京胸科醫院連續住院的216例不明原因胸腔積液患者為研究對象，其中，男153例，女63例，年齡15～91歲，中位年齡為46歲，1例患者HIV檢測陽性。納入患者入院時均進行外周血TSPOT.TB檢測、胸部X線或CT檢查、胸部彩色多普勒超聲檢查及呼吸道（痰或支氣管灌洗液）GeneXpert MTB/RIF檢測、BACTEC MGIT 960培養、分枝桿菌羅氏培養。入院后行胸腔穿刺術或胸腔置管術，留取胸腔積液，并對胸腔積液進行常規、生化檢測、病理學檢查以及CF.TB、SAT-PCR、GeneXpert MTB/RIF 檢測。所有患者至少隨訪12個月以明確最終的診斷信息。

二、研究方法

1.結核性胸膜炎診斷標準：采用臨床復合標準（composite reference standard，CRS）作為參考標準［3］，即指符合Light診斷標準的滲出性胸腔積液，且滿足以下標準之一。（1）胸腔積液或胸膜組織分離出結核分枝桿菌或其核酸檢測陽性；（2）胸膜組織病理學明確找到干酪樣壞死或不典型肉芽腫，伴或不伴抗酸染色陽性且抗結核治療有效并隨訪至少12個月；（3）痰或支氣管灌洗液涂片或GeneXpert MTB/RIF陽性或分枝桿菌培養陽性；（4）患者有發熱、咳嗽、咳痰、乏力、盜汗等結核中毒癥狀，胸腔積液為滲出性、ADA增高伴有結核菌素純蛋白衍生物（PPD）皮膚試驗中度以上陽性或抗結核抗體陽性或血T-SPOT.TB檢測陽性，經臨床醫生判斷為結核性胸膜炎且抗結核治療有效并隨訪至少12個月。

2.其他病因胸腔積液：（1）惡性胸腔積液：胸腔積液或胸膜組織中檢測到惡性腫瘤細胞；（2）其他病因所致胸腔積液：有明確病因的胸腔積液且未接受抗結核治療并至少隨訪12個月。

3.分組：根據患者最終診斷結果將患者分為結核性胸膜炎組和非結核性胸膜炎組。非結核性胸膜炎組包括惡性胸腔積液、感染性胸腔積液和其他病因胸腔積液（胞內分枝桿菌感染、結節病、結締組織病、梅格斯綜合征）。

4.胸腔積液實驗室檢測技術與方法：（1）CF.TB檢測：①樣本準備：采集40 ml胸腔積液，通過4℃3000×g離心10 min留取上清液5 ml，再通過4℃16 000×g離心10 min，留取上清液，用于游離核酸提取；②游離核酸提取：按照游離核酸提取試劑盒（Qiagen Hilden，Germany）的要求按步驟進行操作提取胸腔積液cf-DNA；③檢測：使用結核分枝桿菌實時熒光定量PCR試劑盒（廣州達安生物工程股份有限公司）檢測上清液中結核分枝桿菌目的基因片段IS6110，然后進行定量分析。（2）SAT-PCR 檢測：采集5 ml胸腔積液經3000×g離心10 min留取細胞沉淀，然后按1∶100的比例用稀釋液進行稀釋，采用實時熒光核酸恒溫擴增檢測試劑盒（上海仁度生物科技有限公司）的要求按步驟進行操作。（3）GeneXpert MTB/RIF 檢測：50 ml胸腔積液經3000×g離心10 min棄上清，保留沉渣。向沉渣中加入2 ml標本處理液振蕩均勻后轉入有螺旋蓋的無菌管中，室溫放置15 min。然后取2 ml液化標本至GeneXpert MTB/RIF反應試劑盒，并將其置于GeneXpert檢測儀器（美國Cepheid公司）中，2 h內儀器自動完成檢測。（4）T-SPOT.TB 檢測：按照T-SPOT.TB試劑盒（英國牛津Immunotec公司）說明書進行操作。以斑點形成細胞（spot forming cells，SFC）計數，我院臨床所用參考值為早期分泌抗原靶蛋白6（early secreted antigenic target of 6 kDa，ESAT-6）或培養濾液蛋白10（culture filtrate protein-10，CFP-10）任一個≥24 SFC/106即為T-SPOT.TB陽性。（5）BACTEC MGIT 960培養：取10 ml胸腔積液經3000×g離心10 min后棄上清，保留沉渣。沉渣經標本處理液處理后取0.5 ml放于BACTEC MGIT 960全自動快速分枝桿菌培養鑒定藥敏儀（美國BD 公司）中培養42 d，儀器報告陽性后，取培養液進行涂片鏡檢，若發現抗酸桿菌則為陽性，若未發現抗酸桿菌則為陰性。（6）分枝桿菌羅氏培養：取10 ml胸腔積液經3000×g離心10 min后，保留沉渣。沉渣經前標本處理液處理后，取0.1 ml按照《結核病實驗室檢驗規程》［19］制定的菌株分離培養方法進行檢測和報告。

5.結核性胸膜炎患者亞組分組方法：典型結核性胸膜炎患者常具有青年男性、合并肺結核、胸腔積液ADA≥40 U/L 等臨床特點［20］。這些臨床特點常是診斷結核性胸膜炎的重要參考指標。因而，缺乏上述臨床特點的不典型結核性胸膜炎患者常診斷困難。亞組分組方法：（1）根據患者年齡分為青年組（15～39歲）、中年組（40～59歲）和老年組（≥60歲）；按是否合并肺結核分為肺結核組和無肺結核組；按呼吸道病原學檢測結果分為陽性組、無痰或陰性組；按ADA結果分為ADA≥40 U/L組和ADA＜40 U/L組；按性別分為男性組和女性組；（2）按照臨床特點分為典型結核性胸膜炎患者和非典型結核性胸膜炎患者。典型胸膜炎患者臨床特點包括以下之一：①年齡為中青年；②合并肺結核；③呼吸道病原學陽性；④ADA≥40 U/L；⑤男性。非典型胸膜炎患者臨床特點包括以下之一：①年齡為老年；②無肺結核；③呼吸道病原學陰性；④ADA＜40 U/L；⑤女性。

6.胸腔鏡檢查：術前患者均進行胸部CT、彩色多普勒超聲檢查，明確患者胸腔積液量和膈肌位置。術中患者一般選擇健側臥位，患側腋中線與第5～8肋間交叉點為合適的進鏡點。常規消毒麻醉，切開皮膚1～2 cm，逐層皮下鈍性分離肌肉進入胸腔，插入LTF240胸腔鏡（日本Olympus公司），吸出胸腔積液，然后對壁層胸膜行多點活檢。操作結束后退出胸腔鏡并放置閉式引流管，縫合切口。觀察患者生命體征。最后將胸膜標本進行病理學和病原學檢測。

三、統計學處理

采用SPSS 22.0統計學軟件進行數據分析，對計量資料符合正態分布者以“”描述，偏態資料采用“中位數（四分位數）［M（Q1，Q3）］”描述。兩組均數的比較采用t檢驗，中位數的比較采用秩和檢驗。亞組之間樣本率的比較采用χ2檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

結果

一、研究對象一般資料

216例患者中165例臨床確診為結核性胸膜炎，其中胸腔積液MGIT 960 培養陽性25 例（15.15%，25/165），痰或BALF GeneXpert MTB/RIF檢測陽性49例（29.70%，49/165），經胸膜活檢確診21例（12.73%，21/165），其他70例（42.42%，70/165）無病原學證據。51例確診為非結核性胸膜炎患者，其中惡性胸腔積液39 例（76.47%），包括腺癌20例、惡性間皮瘤14例、淋巴瘤2例、鱗癌1例、胸腺瘤1 例、前列腺癌1 例；感染性胸腔積液8 例（15.69%），其他原因4例，包括胞內分枝桿菌感染、結節病、結締組織病、梅格斯綜合征各1例。

二、結核性胸膜炎組和非結核性胸膜炎組患者的臨床資料

結核性胸膜炎組患者中位年齡（40歲）明顯低于非結核性胸膜炎組（58歲），而且男性患者明顯多于非結核性胸膜炎組，其男性患者占76.36%（126/165）。結核性胸膜炎組患者血清T-SPOT.TB陽性率（87.27%）明顯高于非結核性胸膜炎患者（37.25%），差異有統計學意義（表1）。

表1 兩組患者臨床資料

三、胸腔積液CF.TB、SAT-PCR和GeneXpert MTB/RIF 3種分子生物學檢測方法在結核性胸膜炎中診斷效能的評價

以CRS 為參考標準，比較CF.TB、SAT-PCR和GeneXpert MTB/RIF 3 種檢測方法的診斷效能。胸腔積液CF.TB、SAT-PCR 和GeneXpert MTB/RIF方法診斷結核性胸膜炎的敏感度分別為70.30%（116/165）、7.88%（13/165）和12.12%（20/165）。CF.TB檢測敏感度明顯高于SAT-PCR、GeneXpert MTB/RIF，差異均有統計學意義（χ2=1.350、1.153，P值均=0.000），而且CF.TB 敏感度也明顯高于分枝桿菌培養（15.15%，25/165），差異有統計學意義（χ2=1.012，P=0.000）；SATPCR的敏感度略低于GeneXpert MTB/RIF，但差異無統計學差異（χ2=1.650，P=0.199）（表2）。3種診斷方法檢測敏感度進行交叉比較，結果顯示12例患者SAT-PCR 檢測和CF.TB 檢測同時陽性，19例患者GeneXpert MTB/RIF檢測和CF.TB檢測同時陽性。

表2 以CRS為參考標準評價三種檢測方法的診斷效能

四、胸腔積液CF.TB與ADA、T-SPOT.TB對結核性胸膜炎的診斷價值

以CRS 為參考標準，比較CF.TB、ADA、T-SPOT.TB的診斷效能。胸腔積液CF.TB、ADA和血T-SPOT.TB方法診斷結核性胸膜炎的敏感度分別為70.30%（116/165）、67.27%（111/165）和87.27%（144/165）。CF.TB檢測敏感度明顯高于ADA，但低于T-SPOT.TB，差異均有統計學意義（χ2=1.025、1.264，P值均=0.000）。CF.TB 與ADA兩種方法聯合檢測對結核性胸膜炎診斷的敏感度為88.48%（146/165），其敏感度明顯高于CF.TB單獨檢測，差異有統計學意義（χ2=16.670，P=0.000）（表3）。

表3 以CRS為參考標準評價CF.TB和ADA方法的診斷效能

五、胸腔積液CF.TB對不典型結核性胸膜炎患者的診斷價值

CF.TB、SAT-PCR、GeneXpert MTB/RIF方法對結核性胸膜炎患者年齡、性別、是否合并肺結核、呼吸道病原學及ADA 各亞組的敏感度進行分析，結果顯示這三種檢測方法在各亞組中檢測敏感度差異均無統計學意義。但CF.TB在不典型結核性胸膜炎患者各亞組中均有較高的敏感度，在不合并肺結核組、無痰或呼吸道病原學陰性組、胸腔積液ADA＜40 U/L 組、中年及老年組陽性率分別為61.02%（36/59）、68.97%（80/116）、64.81%（35/54）、70.83%（34/48）及61.11%（22/36），提示CF.TB檢測對臨床不典型結核性胸膜炎患者的早期診斷有較高價值（表4）。

表4 三種檢測方法在結核性胸膜炎各亞組中的診斷價值

續表4

六、胸腔積液CF.TB檢測降低有創檢查

21例結核性胸膜炎患者是通過內科胸腔鏡或胸膜活檢檢查而確診。21 例患者中15 例患者（71.43%）胸腔積液CF.TB檢測陽性。

討 論

結核性胸膜炎是結核分枝桿菌侵犯胸膜引起的胸膜IV型變態反應，是我國胸腔積液最常見的原因［1］。但因結核性胸膜炎患者胸腔積液中含菌量低，目前臨床常用NAAT檢測方法很難在胸腔積液中找到病原學證據，達到早期診斷結核性胸膜炎的目的，亟需尋找新的分子生物學診斷方法。CF.TB是近年出現的一種新型分子生物學診斷方法［16-17］。本研究通過納入216例不明原因胸腔積液患者，分析了CF.TB對結核性胸膜炎的診斷價值。結果發現以CRS為參考標準，胸腔積液CF.TB診斷結核性胸膜炎的敏感度（70.30%）明顯高于SAT-PCR（7.88%）、GeneXpert MTB/RIF（12.12%）及ADA（67.27%），而且該方法能降低臨床胸腔鏡或胸膜活檢等有創檢查的使用。

cf-DNA是由凋亡或壞死細胞釋放到細胞外的小分子DNA 片段，可存在于人類血清、血漿、腦脊液、尿液、唾液及各種體液［12］。cf-DNA 檢測目前在孕婦產前診斷、腫瘤檢測、器官移植術后排斥和感染檢測等領域廣泛應用［13-15］。CF.TB是通過檢測結核分枝桿菌復合群特異性cf-DNA 而建立的一種新的結核分枝桿菌檢測方法［18］。該技術靶基因是結核分枝桿菌特異性插入序列IS6110，該片段在結核分枝桿菌中不僅拷貝數多，而且降解迅速，不同于傳統NAAT檢測方法（例如GeneXpert MTB/RIF和SAT-PCR）。GeneXpert MTB/RIF是一種可在2 h內完成結核分枝桿菌基因和利福平耐藥檢測的全自動實時定量PCR技術，其檢測結核分枝桿菌靶基因是基于利福平耐藥基因決定區rpoB基因［21］。SAT-PCR技術是新一代恒溫RNA 擴增技術，其是以結核分枝桿菌特異16S rRNA 為靶基因［22］。CF.TB作為一種新的診斷方法，在肺結核及肺外結核中的診斷價值尚不清楚。Yu等［23］研究CF.TB在肺結核和肺外結核中的診斷價值，顯示以CRS為參考標準，其診斷肺結核和肺外結核的敏感度分別為78%和65%，而且血漿CF.TB敏感度高于非血漿（胸腔積液、腦脊液、腹腔積液），提示CF.TB對結核性胸膜炎可能具有較好診斷價值。由于結核性胸膜炎是結核分枝桿菌直接感染胸膜或其代謝物進入機體胸膜腔而引起胸膜的局部免疫反應［1］，胸腔積液CF.TB 檢測結核分枝桿菌陽性率應高于血液。為此，本研究比較了胸腔積液CF.TB方法與傳統NAAT方法在結核性胸膜炎中的診斷價值，結果顯示以CRS為參考標準，CF.TB方法診斷結核性胸膜炎的敏感度（70.30%）遠高于SAT-PCR 技術（7.88%）和GeneXpert MTB/RIF技術（12.12%）。CF.TB較上述傳統NAAT方法敏感度高的原因可能有以下幾點：（1）傳統NAAT 檢測靶基因是結核分枝桿菌基因組DNA，而CF.TB檢測是結核分枝桿菌插入序列片段IS6110。結核性胸膜炎患者胸腔內結核分枝桿菌含量較低，TB-DNA 不容易檢測，而IS6110 拷貝數卻較高，容易檢測。Yang等［24］研究顯示CF.TB方法檢測結核分枝桿菌的最低下限為1.25 CFU/μl，而以往文獻研究報道GeneXpert MTB/RIF檢測結核分枝桿菌最低濃度為112.6 CFU/ml［7，21］，說明CF.TB檢測結核分枝桿菌下限遠遠低于傳統NAAT 方法；（2）cf-DNA穩定性較基因組DNA 差。研究表明胎兒cf-DNA 1～2 d內就從母體血漿和尿液里被清除，而各種病原體cf-DNA當被治療后也能很快被機體清除，說明cf-DNA能反映機體最近的感染狀態［25-26］。這些結果提示CF.TB對結核性胸膜炎具有較好的診斷價值。

CF.TB作為一種新的分子生物學方法，其操作方法較傳統NAAT相對簡單，而且價格也僅為傳統NAAT的一半。對于病原學診斷困難的結核性胸膜炎患者，CF.TB可能成為其輔助診斷的方法。為此，筆者將CF.TB、GeneXpert MTB/RIF和SATPCR這3種方法在結核性胸膜炎中的診斷效能進行交叉分析比較，結果顯示12例患者SAT-PCR檢測和CF.TB檢測同時陽性，19例患者GeneXpert MTB/RIF檢測和CF.TB檢測同時陽性。這些結果提示CF.TB 可作為結核性胸膜炎的輔助診斷方法。

胸腔積液ADA 和血T-SPOT.TB是臨床上診斷結核性胸膜炎常用的生物學標志物［8-9，27］。本研究比較了CF.TB和ADA、T-SPOT.TB檢測在結核性胸膜炎中診斷價值，結果顯示CF.TB診斷結核性胸膜炎的敏感度（70.30%）高于ADA（67.27%），低于T-SPOT.TB（87.27%），但其特異度（100.00%）明顯高于ADA（92.16%）和TSPOT.TB（62.75%）。若將CF.TB和ADA 兩者聯合，可明顯提高其診斷結核性胸膜炎的敏感度（88.48%）。ADA對結核性胸膜炎診斷的特異度差的原因可能因為ADA是一種與機體免疫細胞活性有重要關系的嘌呤核苷代謝酶。胸腔積液ADA 升高可見于多種疾病（例如結核性胸膜炎、膿胸、肺癌、淋巴瘤、類風濕性關節炎等）。本研究中有4例非結核性胸膜炎患者ADA＞40 U/L。而T-SPOT.TB特異度差可能與我國是結核分枝桿菌潛伏感染高危區有關。本研究中有37.25%（19/51）非結核性胸膜炎患者T-SPOT.TB陽性。這些結果提示CF.TB對結核性胸膜炎較ADA 有更好的診斷價值，CF.TB與ADA聯合檢測可大幅度提高結核性胸膜炎的早期診斷，CF-TB不受結核分枝桿菌潛伏感染的影響。

典型結核性胸膜炎患者結合臨床表現和實驗室檢查可獲得臨床診斷。但對于臨床表現不典型、胸腔積液ADA達不到診斷界值、痰或呼吸道病原學陰性等不典型結核性胸膜炎患者很難達到臨床診斷。本研究165例結核性胸膜炎患者中，僅有57.58%（95/165）患者通過痰、BALF、胸腔積液或胸膜組織獲得病原學證據，其他42.42%（70/165）患者仍需結合其他輔助方法和診斷性抗結核治療等結果進行臨床診斷。因此，本研究回顧性分析CF.TB對上述不典型結核性胸膜炎患者的診斷價值。結果顯示，CF.TB方法對不典型結核性胸膜炎患者診斷陽性率也高達60%～70%。而且在需行內科胸腔鏡檢查才確診的結核性胸膜炎患者中，有71.43%（15/21）的患者CF.TB檢測陽性。這些結果提示CF.TB在臨床應用中具有廣泛適用性，可有效減少臨床有創檢查。本研究還存在不足之處：本研究為單中心診斷試驗，而且研究中心為結核病專科醫院，可能導致結果有局限性，還需大樣本多中心臨床研究進一步驗證。

綜上所述，胸腔積液CF.TB檢測是一種新的靈敏、特異、快速、簡便的分子生物學診斷技術，其診斷結核性胸膜炎的敏感度優于傳統NAAT方法，可推薦用于病原學獲得困難的患者（如肺外結核、胸膜炎、兒童/年老體弱無法取痰者等）的輔助診斷，而且CF.TB與ADA 聯合能有效提高結核性胸膜炎的早期診斷。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

作者貢獻張蕓、李琨、梁清濤：數據的采集與分析，論文撰寫和修改；劉子臣：標本的檢測；段鴻飛、李雪蓮、郭茹：標本收集；車南穎、楊新婷：實驗設計和實施實驗、論文修改及研究經費支持