B細胞非霍奇金淋巴瘤病人尿液中揮發性標志物的篩選及鑒定

劉曉莉,張妮,趙龍,董琳

(1 青島市市立醫院檢驗科,山東 青島 266011； 2 青島市海慈醫療集團檢驗科； 3 山東省千佛山醫院血液內科)

非霍奇金淋巴瘤(NHL)是最常見的血液惡性腫瘤，近年來其發病率迅速上升[1]。85%的NHL為B細胞來源。根據其臨床特征，B細胞NHL(B-NHL)一般分為侵襲性和惰性兩大類[1]。其中惰性B-NHL約占1/3，被認為是復發難治性淋巴瘤[2-3]。

B-NHL缺乏特異的臨床癥狀，使得其早期診斷的可行性較差。近年來，計算機斷層掃描和磁共振成像方法等常用于提示診斷[4-5]。B-NHL的臨床病理診斷，會給病人帶來一定的穿刺痛苦和經濟負擔[6]。因此，需要開發一種新的無創性診斷方法，區分B-NHL的病理分型，監測其發生發展。與病理診斷和成像方法相比，檢測腫瘤標志物更便捷、更經濟[7]。代謝組學分析是對生物體內所有代謝物進行定量分析，尋找代謝物與生理病理變化相對關系的研究方式，是系統生物學的組成部分。疾病導致機體病理生理過程變化，最終引起代謝產物發生相應的改變，通過對某些代謝產物進行分析，并與正常人的代謝產物比較，尋找疾病的生物標記物，可為疾病診斷提供參考。因其無創性和足夠的體積，尿液被認為是理想的代謝組學分析物質[8]。由于癌癥引起嚴重的代謝紊亂，尿液揮發性有機物的綜合分析可能有助于尋找癌癥的代謝生物標志物[9]。本研究使用頂空固相微萃取結合氣相色譜-質譜方法對B-NHL病人尿液中揮發性有機物進行了初步分析[10-11]，以評估尿液中揮發性有機物作為B-NHL鑒別診斷標志物的可能性。

1 材料與方法

1.1 主要材料

尿液中定量化合物所用HPLC級標準品購自Sigma公司。氦(純度為99.999%)由中國山東濟寧協力特種氣體有限公司生產。便攜式pH值測試筆(R&D，MN，USA)，聚四氟乙烯(PTFE)隔膜覆蓋20 mL氣相色譜GC瓶(Shimadzu，Kyoto，Japan)。SPME手工固定器和75 μm羧基聚二甲基硅氧烷纖維(Sigma-Aldrich)。GC-MS QP 2010氣相色譜質譜聯用儀由島津公司生產。

1.2 研究對象

從2015—2017年在青島市市立醫院就診的淋巴瘤病人中，選取50例未經治療的臨床病理診斷為B-NHL的病人作為實驗組，選取20例臨床病理診斷為淋巴結反應性增生的病人及10例健康的家屬作為對照組。排除標準：有癌癥病史；妊娠或哺乳期女性；有代謝性疾病，如糖尿病等；有肝臟或泌尿系統疾病；吸煙或飲酒者；使用特定藥物，如抗生素、糖皮質激素、非甾體類藥物等。50例B-NHL病人中，男性27例，女性23例；平均年齡(55.4±15.6)歲；侵襲性B-NHL者17例，惰性B-NHL者33例。在17例侵襲性B-NHL病人中，根據安娜堡分期系統分期，早期(Ⅰ～Ⅱ期)者7例，晚期(Ⅲ～Ⅳ期)者10例；CD20陽性表達者11例，陰性表達者6例；國際預后指數(IPI)低分(0～2分)者8例，高分(3～5分)者9例。在33例惰性B-NHL病人中，早期者11例，晚期者22例；CD20陽性表達者10例，陰性表達者23例；IPI低分者15例，高分者18例。對照組30例，男性21例，女性9例；平均年齡(45.7±14.3)歲。所有受試者參加本研究均簽署知情同意書。本研究得到了青島市市立醫院醫學倫理委員會的批準，人體尿液的使用符合《赫爾辛基宣言》指南。

1.3 樣品制備及揮發性有機物的篩選

所有受試者夜間禁食禁水，在禁食禁水期間，用一個30 mL量程無菌玻璃瓶(山東浩鑫玻璃制品有限公司)收集所排尿液，隨后密封玻璃瓶，4 ℃下保存，并且在收集1 h內送至青島市市立醫院檢驗科實驗室完成氣相色譜-質譜等分析。將尿液樣品分為10 mL等分試樣，放在20 mL液相色譜瓶中，根據最終所需pH值，分別加入0.1 mL的5 mol/L HCl、5 mol/L NaOH和超純水。將標準分析物(在甲醇中制備)加入到一個20 mL液相色譜瓶中，依次添加3 g氯化鈉、0.1 mL的5 mol/L HCl、0.1 mL 的5 mol/L NaOH和超純水，制備校準樣品。將尿液加入到一個20 mL液相色譜瓶中，依次添加3 g氯化鈉、0.1 mL的5 mol/L HCl、0.1 mL 的5 mol/L NaOH和超純水，制備對照樣品。將10 mL超純水加入到一個20 mL液相色譜瓶中，依次添加3 g氯化鈉、0.1 mL的5 mol/L HCl、0.1 mL 的5 mol/L NaOH和超純水，制備空白樣品。采用校準樣品和對照樣品評價分析線性度，采用空白樣品評價分析方法的精密度、檢測和定量限值。在酸化、堿化、未改性的pH值條件下，通過與2015版美國國家標準與技術局(NIST)化學數據庫中收錄的揮發性有機物進行比對，分析尿液中的碎片信號和強度，并通過使用基于標準化合物的內部保留時間庫來分析差異性標志物的保留時間，鑒定不同類型B-NHL病人的尿液譜。

1.4 氣相色譜-質譜分析

將待檢樣品置入頂空瓶中，加蓋密封，隨即將萃取頭穿透瓶蓋插入頂空瓶，推出萃取頭纖維，使其置于液平面上空，將頂空瓶連同萃取頭放于40 ℃恒溫箱中靜置30 min，使萃取頭充分萃取尿液揮發性有機物。萃取后，退回纖維頭，小心拔出萃取頭，將其手動插入氣相色譜-質譜進樣口，推出纖維頭。氣相色譜注入口溫度為250 ℃，氣相載氣為氦氣，流量為1 mL/min，采用無分流模式。柱烘箱溫度35 ℃，保持2 min；以6 ℃/min速度升溫到150 ℃；以12 ℃/min速度升溫到250 ℃，保持3 min。質譜儀的離子源溫度為200 ℃，檢測器工作在45～350質荷比(m/z)的范圍內。高溫解析5 min后再讀數據。

1.5 統計學分析

2 結 果

2.1 揮發性有機物的篩選和鑒定

鑒定出的揮發性有機物包括醛、酮、酸、醇、苯衍生物、酚、酯、呋喃和含硫化合物等各種化學族。本研究還進一步評估了具有最高豐度、最高文庫比對百分比以及B-NHL病人和健康對照者尿液中具有統計學差異的揮發性有機物碎片離子m/z。在所有pH值條件下一共鑒定出170種揮發性有機物，其中28種揮發性有機物在全部B-NHL病人的尿樣中出現。酸化樣品檢測到115種揮發性有機物，其中20種在所有樣本中存在。堿化樣品檢測到126種揮發性有機物，其中23種普遍存在。未修飾pH值條件下尿樣中檢出77種揮發性有機物，其中21種普遍存在。最終篩選出了9種在堿化、酸化、未修飾pH值條件下尿樣中共有的揮發性有機物，分別為丙酮、2-丁酮、4-庚酮、二甲基二硫醚、呋喃、2-甲基丁醛、2-甲基吡嗪、癸酸和2,6-二甲基-7-辛烯-2-醇等。見表1。

2.2 揮發性標志物的定量分析

與健康對照者相比，B-NHL、淋巴結反應性增生病人尿液標本中4-庚酮、2-甲基吡嗪、2-甲基丁醛、癸酸和2,6-二甲基-7-辛烯-2-醇水平差異有顯著性(t=2.493～13.643，P<0.05)。侵襲性B-NHL和惰性B-NHL病人之間4-庚酮、癸酸的濃度存在統計學差異(t=2.109、2.101，P<0.05)。淋巴結反應性增生病人和B-NHL病人之間4-庚酮、2-甲基吡嗪濃度存在統計學差異(t=6.737、2.693，P<0.05)。見表2。

表1 B-NHL病人尿液中揮發性有機物的篩選及鑒定

2.3 揮發性標志物的診斷價值

ROC曲線分析結果顯示，能鑒別B-NHL與非淋巴瘤的揮發性標志物為4-庚酮、2-甲基吡嗪、2-甲基丁醛(AUC=0.634～0.961，P<0.05)；4-庚酮、2-甲基丁醛、癸酸是區分侵襲性和惰性B-NHL的理想揮發性標志物(AUC=0.657～0.795，P<0.05)；4-庚酮和2,6-二甲基-7-辛烯-2-醇可以用于區分早期淋巴瘤和晚期淋巴瘤(AUC=0.772、0.754，P<0.05)；2-甲基丁醛和癸酸可以用于區分CD20+和CD20-淋巴瘤病人(AUC=0.852、0.851，P<0.05)。聯合上述揮發性標志物建立的診斷模型比單一標志物具有更高的診斷價值。見表3。

3 討 論

B-NHL在發病的早期階段無顯著臨床特征，大多數B-NHL病人預后差[12]。早期診斷的侵襲性B-NHL病人其預后顯著優于晚期診斷的病人，因此，B-NHL的早期診斷意義重大。以揮發性化合物作為造血淋巴系統惡性腫瘤的早期診斷標志物具有檢測量少、無創性和經濟負擔小的優勢[13-14]。本研究采用氣相色譜-質譜聯用技術并聯合頂空固相微萃取方法對尿液中揮發性有機物進行分析，結果顯示，B-NHL病人與淋巴結反應性增生病人、健康對照者比較，尿液中含量有顯著差異的揮發性有機物為4-庚酮和2-甲基吡嗪，其中4-庚酮在早期和晚期淋巴瘤病人尿液中含量差異亦有顯著性，提示4-庚酮具有作為B-NHL早期診斷尿揮發性標志物的可行性[8,14]。這與國內HUA等[8]的研究報道一致。

此外，本研究結果顯示，尿液中揮發性有機物4-庚酮、2-甲基丁醛、癸酸和2,6-二甲基-7-辛烯-2-醇能夠明顯識別B-NHL的關鍵特征，如CD20+和CD20-、早期和晚期。這些指標的診斷靈敏度在70.4%～78.0%之間，特異度在79.4%～91.0%之間，這與國內HUA等[8]的研究結果相似。目前而言，B-NHL的臨床分期主要依據CT、MRI、PET-CT或者侵襲性骨髓病理學穿刺等較為昂貴的檢查方法[16]。尿液中揮發性有機物的檢測是一種廉價、無創的檢測方法，對B-NHL的臨床分期有較好的診斷價值[8,13]。目前B-NHL病人CD20表達的分類主要依賴免疫組織化學病理評分，存在較大的主觀性[17]。由于基層醫院嚴重缺乏優秀的病理醫師，因此對于B-NHL診斷經常遇到因CD20導致的誤診甚至漏診[18]。而尿液中揮發性有機物作為一種客觀的補充診斷方法，有望提高對CD20的診斷準確率。本文ROC曲線分析結果顯示，能鑒別B-NHL與非淋巴瘤的揮發性標志物為4-庚酮、2-甲基吡嗪、2-甲基丁醛，其中最佳揮發性標志物為4-庚酮，區分侵襲性和惰性B-NHL的理想揮發性標志物是4-庚酮和癸酸；聯合揮發性標志物建立的診斷模型比單一標志物具有更高的診斷價值，既可用于區分淋巴結反應性增生與B-NHL，也可用于區分侵襲性與惰性B-NHL。這提示尿液中的揮發性標志物或許亦可預測B-NHL的臨床預后，但需要后期進一步研究驗證。

表2 兩組尿液標本中揮發性有機物濃度比較

表3 ROC曲線分析揮發性標志物的診斷價值

揮發性化合物可能經多種內源性生化途徑和外源性途徑(環境污染、食物、煙草和乙醇等)產生。在內源性來源方面，已知在病理過程中可以產生新的揮發性有機物或揮發性有機物水平可以發生改變。例如，增加的活性氧可以攻擊細胞膜中的多不飽和脂肪酸，從而產生揮發性有機物。揮發性化合物可作為惡性腫瘤的早期診斷標志物，其前提是腫瘤在早期階段有顯著的代謝紊亂。為減少外源性來源的混雜因素影響，本研究排除了吸煙者和飲酒者，且各組受試者的飲食習慣沒有顯著差異。因此，本研究結果能夠較為真實地反映出B-NHL病人與淋巴結反應性增生病人和健康對照者尿液揮發性有機物的含量差異。

總之，本研究證實，尿液中揮發性有機物4-庚酮、2-甲基吡嗪、2-甲基丁醛有望用于鑒別診斷B-NHL，4-庚酮、癸酸有望用于區分惰性與侵襲性B-NHL，4-庚酮和2,6-二甲基-7-辛烯-2-醇有望用于區分早期和晚期淋巴瘤病人，2-甲基丁醛和癸酸有望用于鑒別CD20+和CD20-淋巴瘤病人，單獨或聯合檢測上述指標可能為B-NHL臨床診斷提供參考。