偽狂犬病病毒FJMH1907b株的分離和gD基因的演化分析

吳學敏 汪翊靈 陳如敬 陳秋勇 王隆柏 車勇良 嚴 山 劉玉濤 周倫江＊

（1.福建省農業科學院畜牧獸醫研究所/福建省畜禽疫病防治工程技術研究中心 福州 350013；2.閩侯縣農業農村局畜牧獸醫站 福建閩侯 350100）

偽狂犬病病毒（Pseudorabies virus，PRV）是一種神經性皰疹病毒，可感染多種哺乳動物，包括反芻動物、食肉動物和嚙齒動物，導致易感動物中樞神經系統疾病[1-2]。豬是PRV的天然宿主，偽狂犬?。≒seudorabies，PR）對養豬業危害性大，具有高度隱性感染的特點，可引起持續性感染，特別是耐過的母豬呈長期帶毒生產[3]。2011年以來，我國許多規?；i場暴發了PR，主要表現為豬群PRV-gE抗體陽性率顯著升高，普遍出現母豬流產、仔豬神經癥狀和病死率高等臨床情況，近幾年還相繼發現免疫PR疫苗的養豬場發生偽狂犬病，并分離到新的PRV流行毒株[4-6]，相關研究表明，新分離的PRV毒株出現了變異，而經典毒株的疫苗未能完全保護新型強毒力PRV的感染[7-10]。PRV已發現16種囊膜蛋白，其中11種功能性囊膜蛋白，gD（US6）為糖基化蛋白，是PRV的主要免疫原之一，在病毒感染細胞至復制生長過程中起著重要的作用，也最先被機體免疫系統識別引起免疫應答[11-12]。研究表明，gD蛋白抗體是主要中和抗體之一，能夠充分中和PRV，且不存在補體時也能有效中和[13]。本研究對福建省閩侯縣發生疑似PR的豬場進行PRV分離鑒定，再對新分離PRV毒株gD基因進行PCR擴增，通過測序比對分析，探究豬偽狂犬病病毒gD基因的遺傳進化規律，為PR預防和控制提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 細胞與病毒 PK-15細胞由本研究室保存，用于病毒分離和傳代培養；偽狂犬病病毒參考毒株Fa株由本研究室保存。

1.2 病料與病毒分離 從福建省閩侯縣某豬場采集疑似PRV感染豬的腦、肺、脾臟和肝臟組織，參考文獻[7]的方法，處理病料并接種于PK-15細胞，將發生病變的細胞傳至3～4代，待細胞70%發生病變時收獲病毒液，凍存于-80℃，備用。

1.3 主要試劑 病毒核酸提取試劑盒、PCR擴增高保真酶Mix、GC Buffer等均購自北京全式金公司；DMEM培養基和胰酶購自HyClone公司；犢牛血清購自杭州四季青公司；瓊脂糖、10×TAE緩沖液購自北京索萊寶公司。

1.4 引物設計合成 參考GenBank中PRV基因序列（NC_006151），設計擴增gE基因保守序列的引物和gD基因的引物，序列分別為gE-F：5'-AACTATGGCATGACCGCCAA-3'，gE-R：5'-GTGGAGAAGAAGAGTCCGGC-3'；引物gD-F：5'-ATGATGATGGTGGCGCGCGAC-3'，gD-R：5'-TTATTGTTCTTCTGCGATGGTGGCGAG-3'。引物由鉑尚生物技術公司合成，兩對引物預計擴增的片段大小分別為612 bp和1 100 bp。

1.5 PCR檢測鑒定 按照病毒核酸提取試劑盒說明書提取組織上清液和病毒培養液的病毒DNA作為模板，以Fa株的核酸作為陽性對照，用gE引物進行PCR擴增，產物經1%瓊脂糖凝膠電泳觀察鑒定。

1.6 gD基因擴增 以分離的病毒DNA為模板，用gD引物進行PCR擴增反應，反應條件為：94℃預變性5 min；94℃變性30 s，58℃復性45 s，72℃延伸45 s，進行35個循環；最后72℃延伸10 min。反應結束，取5μL于1%瓊脂糖凝膠電泳觀察結果，并將目的條帶膠回收，送上海鉑尚生物技術公司測序。

1.7 gD基因序列及氨基酸序列分析 將測序結果用DNAStar軟件中SeqBulider程序推導對應的氨基酸序列，挑選GenBank中登錄的具有代表性的15個毒株使用MEGA 5.05和MegAlign軟件進行同源性比對分析，并構建遺傳進化分析樹，探究它們的親緣關系。選取的毒株為Fa株（AY196984）、Min-A株（AY169694）、La株（AY174090）、SA215株（DQ367438）、FZ株（EF645837）、TJ株（KJ789182）、LC株（MF434034）、FJ-Y21株（MK922107）、HNXY株（MN003373）、Anhui-ZJ1株（MK922121）、Kaplan株（AJ271966）、Becker株（AY368490）、NiA3株（KU900059）、Yangsan株（AY217094）和疫苗毒Bartha株（KY398733）。

2 結果與分析

2.1 病毒分離鑒定 于PK-15細胞上穩定傳代的病毒，待接種48 h后可見細胞變圓，出現合胞體，約70%細胞出現病變時收起，進行PCR檢測鑒定，以Fa株作為陽性對照，結果見圖1，分離到的病毒與陽性對照在600 bp處出現明顯條帶，并對PCR產物進行測序，與GenBank中PRV-gD基因序列一致，表明分離的病毒為PRV，命名為FJMH1907b。

圖1 PCR鑒定電泳圖

2.2 gD基因擴增結果 以分離的病毒FJMH1907b株和Fa株核酸為模板，PCR擴增gD基因，結果見圖2，均在1 100 bp處出現預期條帶，將條帶回收送檢測序。

圖2 gD基因PCR擴增電泳圖

2.3 gD核苷酸序列比對分析 將FJMH1907b株gD基因片段擴增測序結果，與GenBank中收錄的15株PRV對應核苷酸序列進行比對分析，由構建的遺傳進化樹可見，新分離FJMH1907b毒株與國外Kaplan毒株及疫苗毒Bartha株不屬于一個大的分支上，與國內FJ-Y21株、Anhui-ZJ1株、LC株及TJ株同屬一個小分支上（見圖3）。

圖3 PRV-gD基因核苷酸序列遺傳進化樹

2.4 gD基因推導氨基酸序列比較 將gD基因推導的氨基酸序列進行比較分析，結果顯示（見圖4）推導出對應氨基酸共369aa，差異較大的區域集中在aa278～aa282，存在連續氨基酸缺失或增加，另aa287、aa341存在A-V和P-Q互換；部分毒株個別氨基酸也存在突變，主要變化有A105V、I121V、R276K、F323L、S355P，其中疫苗毒Bartha株的aa81存在N突變成S，新分離FJMH1907b株的aa271存在R突變成Q。

圖4 gD基因推導氨基酸序列比較

2.5 gD基因推導氨基酸序列比對分析 將gD基因推導的氨基酸序列進行比對分析，構建的遺傳進化樹顯示（見圖5），與核苷酸序列的比對結果相似，新分離FJMH1907b毒株處于相對獨立分支，與國外Kaplan毒株及疫苗毒Bartha株不屬于一個大的分支上，與國外Becker毒株、NiA3株也不在一個分支上，與國內Fa株、FZ株、FJ-Y21株、Anhui-ZJ1株、LC株及TJ株同屬一個較小分支上。

圖5 PRV-gD氨基酸序列遺傳進化樹

2.6 gD氨基酸同源性比較分析 根據推測的氨基酸序列，采用MAGE軟件比對獲得PRV gD蛋白氨基酸同源性比對矩陣，結果顯示（見圖6）：新分離FJMH1907b毒株與其它參考毒株的同源性為87.7%～100%，與國外毒株的同源性為87.7%～99.7%，其中與疫苗毒Bartha株的同源性僅87.7%、韓國Yangsan株為99.7%；與國內Fa株、FJ-Y21株、TJ株、Anhui-ZJ1株及LC株同源性為100%。

圖6 gD氨基酸序列同源性矩陣

3 討 論

PRV為線性雙股DNA病毒，基因全長約150 kb，其中G+C含量高達73%，編碼的囊膜蛋白中有11種是糖偶聯蛋白，包括gL、gH、gB、gC、gN、gD、gI和gE蛋白等，大部分與病毒的入侵感染和復制生長增殖密切相關，部分也直接參與宿主的免疫反應，產生相應的抗體[1,2,14-15]。gD蛋白也是主要免疫原性糖蛋白之一，是病毒感染過程所必需的，具有高度保守性，是機體中和抗體的目標蛋白之一[11]。gD蛋白氨基酸序列分析和蛋白空間構象研究表明，gD蛋白具有跨膜區、細胞膜結合位點和信號肽區的典型免疫活性特性[16]。自2011年以來，我國出現新的PRV流行毒株，陸續相關研究發現新毒株毒力基因和抗原保護性基因均出現一定的變異，也給該病的防控帶來新的挑戰[17]。部分規?；i場的豬群PRV-gE抗體陽性率顯著升高，出現母豬流產、仔豬神經癥狀和死亡率升高等情況，甚至還發現部分免疫PR疫苗的豬場發生偽狂犬病，并分離到新的PRV流行毒株。相關研究表明，新分離的PRV毒株出現了變異，而經典毒株的疫苗未能完全保護新型強毒力PRV的感染[8-10]。

本研究對新分離的PRV毒株FJMH1907b株的gD基因核苷酸序列和對應氨基酸序列與參考毒株進行對比分析，結果顯示福建新分離FJMH1907b毒株與疫苗毒Bartha株不屬于一個大的分支上，且兩者對應的氨基酸序列同源性為87.7%，這可能是導致該豬場偽狂犬病免疫失敗而發病的原因之一，或PRV經典毒株疫苗對新型毒株不能提供完全保護。PRV gD蛋白具有高度保守性，氨基酸序列比對分析結果顯示，不同地域分離的毒株具有一定差異，主要集中在aa278～aa282位置存在連續氨基酸缺失或增加，以及在aa276、aa287、aa341存在R-K、A-V和P-Q互換，新分離FJMH1907b株gD蛋白氨基酸也存在上述變化，同時在aa271存在R突變成Q。因此，本研究對PRV gD基因核苷酸序列和對應氨基酸序列進行對比分析發現，gD蛋白較保守，但存在一定地域差異性，與徐志文等研究結果一致[16]；與國外Bartha株存在較大的差異，兔源gD蛋白多抗血清對不同PRV毒株交叉中和效價差異不顯著[18]，或許PRV gD蛋白個別氨基酸的突變不會引起其抗原性重大改變，但新分離FJMH1907b株gD基因及對應氨基酸序列的比對分析結果，結合目前豬場PRV的流行情況，對該病的防控應因地制宜，定期做好病原學和血清學監測，合理安排疫苗免疫。