競爭ELISA法檢測布病終止反應后影響OD值的因素探討

吳 蔚 南平市動物疫病預防控制中心 福建南平 354200

布病，即布魯氏菌病，是由布魯氏菌引起的急性或慢性人畜共患病，廣泛流行于世界許多國家，被我國列為二類動物疫病。該病主要侵害動物的生殖器官，引起家畜不育、流產等。獸醫實驗室對布病抗體的檢測有許多方法，如虎紅平板凝集試驗、試管凝集試驗、競爭ELISA試驗等[1]。競爭ELISA法在實驗室檢測中以精準、方便、快速、高通量獨占優勢[2]，2018年已被列入國家標準。而在競爭ELISA法檢測過程中，有很多需要注意的步驟，但在終止反應后這一階段最容易被檢測人員忽略[3]。本文就這一步驟中可能影響試驗結果的因素（氣泡、放置時間等）進行初步探討。

1 材料與方法

1.1 樣本與試劑 經過虎紅平板凝集試驗初篩后抗體為陰性的牛、羊血清各4份；布魯氏菌病競爭ELISA檢測試劑盒（北京中海生物），試劑盒內的抗體陰性血清、陽性血清。

1.2 儀器 微量移液器、純水儀、生化培養箱、酶標儀。

1.3 方法

1.3.1 終止反應前的試驗操作 將牛、羊血清（各4份，共計8份）以及陰性、陽性標準血清（各1份，共計2份）作為待檢血清按照試劑盒說明進行檢測，同時設置陰性、陽性對照（各2孔），具體步驟大致為：在包被板上加樣 （50μL/孔）、加酶標二抗（50μL/孔）以及抗體工作液（100μL/孔），蓋板，37℃避光溫育；洗板4次，加入底物（100μL/孔），蓋板，37℃避光溫育10 min，加入終止液。

1.3.2 終止反應后的試驗操作 在加入終止液終止反應后，立即用酶標儀在波長450 nm下測定各反應孔的吸光度OD值，之后用微量移液器將各反應孔快速打出氣泡，測定其吸光度OD值，然后再用吸頭戳破氣泡，15 min再次測定各反應孔中的吸光度OD值。

2 結 果

由表1可見，在同一個反應孔中若產生氣泡，其OD值增大；隨著時間延長，其OD值也變大。而在戳破氣泡靜置15 min后反應孔OD值反而小于之前有氣泡時的OD值。

表1 不同處理后各樣本OD值

將打出氣泡的樣本OD值、戳破氣泡靜置15 min的樣本OD值分別與樣本初始（無氣泡）OD值作配對樣本t檢驗，結果見表2。t值分別為-4.701、-5.778；P（Sig.）分別為0.001、0.000，均小于0.05，差異顯著。

表2 不同處理的配對樣本t檢驗

3 討 論

本試驗探討了競爭ELISA法檢測布病抗體時在試驗終止階段可能出現影響結果的因素，在用該方法檢測前已使用虎紅平板凝集試驗對樣品做過初篩，結果均為陰性。考慮到需要抗體陽性作對比，因此，用試劑盒中的陽性對照，即多做一孔作為陽性孔進行對比。

結果表明，無論是陰性還是陽性的反應孔，在加終止液后，反應孔內若存有氣泡，會使得該孔的吸光度OD值明顯變大，從而影響結果的判定。產生氣泡的原因有很多，在移液或洗板階段均有可能發生。因此，移液時應盡量準確，用力均勻，不要過快、過猛帶入空氣導致氣泡的產生；洗板階段，洗滌結束后也應在吸水紙上拍干，避免氣泡殘留。若反應孔出現氣泡，要及時處理，可用微量移液器的吸頭將其戳破。終止反應后，隨著放置時間延長，會增加反應孔的OD值，但在戳破氣泡靜置15 min后的反應孔OD值反而小于之前有氣泡時的OD值，說明放置時間對OD值的影響稍小于存有氣泡。本試驗采用的試劑盒要求在終止反應的5 min內測定結果，但本試驗在15 min后測定的結果仍滿足試驗成立的條件。一般的ELISA檢測中，要求加入終止液的15 min內測定樣品OD值，最好是加完終止液混勻后馬上測定，這是由于在加入終止液后，顯色劑在光的作用下有時仍然會出現非特異顯色，造成誤差。因此，在日常的ELISA試驗過程中，最好提前（15 min以上）做好酶標儀的開機預熱與調試工作，以免終止反應后不能及時讀數，導致結果出現偏差。