番鴨源鴨疫里默氏菌大環內脂類藥物的耐藥基因檢測與分析

林彬彬 謝碧林 翁漢東 王秀禎 程龍飛 傅光華 劉榮昌 林志敏＊

（1.莆田市農業科學研究所 福建莆田 351144；2.福建省農業科學院畜牧獸醫研究所 福州 350013）

鴨疫里默氏菌（Riemerella anatipestifer，RA）是一種黃桿菌科里默氏菌屬革蘭氏陰性菌，是在世界范圍內發現的禽類主要病原菌之一，其引起的高傳染性和高病死率給養鴨業帶來巨大的經濟損失。主要感染鴨、雞、鵝和火雞等，并導致典型的漿膜炎和敗血癥，以嚴重的纖維素性心包炎、肝周炎和氣囊炎為特征。藥物是防治鴨疫里默氏菌病的主要方法，但藥物的廣泛使用也導致了耐藥性菌株的出現。

紅霉素、阿奇霉素是大環內酯類藥物，可逆地與細菌的50S核糖體亞單位結合，抑制肽酰基轉移酶，阻止轉肽作用和mRNA位移，阻斷肽鏈延伸，從而抑制細菌蛋白質的合成[1]。目前，臨床上鴨疫里默氏菌對紅霉素的耐藥性已越來越明顯[2-4]，其藥物應用效果不甚理想。細菌對大環內酯類藥物產生耐藥性的主要機制有四種，一是核糖體RNA的甲基化修飾，主要由紅霉素核糖體甲基化酶（erm）基因編碼的甲基化酶介導，使核糖體靶位點改變，導致藥物與核糖體的親和力降低而產生耐藥[5]；二是核糖體RNA基因發生點突變[6]；三是大環內酯類相關的糖基轉移酶和紅霉素滅活酶的產生，如紅霉素酯酶（ere）可以水解破壞酯內環而產生耐藥[7]；四是通過外排泵將藥物排出體外[8]。目前，erm基因家族有20多種基因型。有研究表明，ermF、ereD基因能引起鴨疫里默氏菌對紅霉素的耐藥[9-10]。本研究主要就莆田市鴨疫里默氏菌對大環內酯類藥物的耐藥性以及相關耐藥基因的攜帶情況進行分析，了解其耐藥水平及耐藥基因流行情況，探究鴨疫里默氏菌對大環內酯類藥物的耐藥機制，為臨床上鴨疫里默氏菌病大環內酯類藥物的應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗菌株 49株番鴨源鴨疫里默氏菌菌株，由本所實驗室分離并保存，所有菌株均已經生化鑒定和PCR鑒定。

1.1.2 主要試劑 胰蛋白胨大豆瓊脂培養基（TSA）、胰蛋白胨大豆肉湯培養基（TSB）、紅霉素藥敏紙片（藥物含量15μg/片）、阿奇霉素藥敏紙片（藥物含量15μg/片），均購于杭州微生物試劑有限公司；新生胎牛血清，購于浙江天杭生物科技股份有限公司；細菌基因組DNA提取試劑盒、2×Taq PCR MasterMix、GeneRed核酸染料、DL2000 DNA Marker，購于天根生化科技有限公司。

1.1.3 引物設計與合成 根據參考文獻[1,9,11]合成大環 內 酯 類 相 關 耐 藥 基 因ermA、ermB、ermC、ermF、ereD等5種，引物序列及其反應參數見表1，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

表1 鴨疫里默氏菌大環內酯類耐藥基因引物

1.2 方法

1.2.1 藥物敏感性試驗 根據CLSI（2018）的要求，采用K-B紙片擴散法測定菌株對大環內酯類藥物（紅霉素、阿奇霉素）的敏感性。取待測菌株接種于TSB液體培養基中，置37℃搖床中，160 r/min培養24 h后，用滅菌生理鹽水將菌液濃度稀釋到0.5個麥氏比濁度。取調整后的100μL菌液于TSA平板上并用無菌涂布棒均勻涂布，待晾干數分鐘后，用無菌鑷子夾取不同的藥敏紙片間隔一定距離貼于TSA平板上，置5%CO2培養箱中，37℃培養24 h，觀察并記錄結果。

1.2.2 耐藥基因的PCR擴增及序列分析 根據細菌基因組DNA提取試劑盒說明書提取菌株DNA為模板，采用PCR方法對菌株中可能存在的ermA、ermB、ermC、ermF、ereD等5種耐藥基因進行擴增。PCR反應體系：2×Taq PCR MasterMix 25μL；上下游引物（10 uM）各1μL；DNA 2μL；補充ddH2O至終體積50μL。PCR擴增程序：96℃預變性5 min；94℃變性1 min，各自退火溫度退火50 s，72℃延伸1 min，共30個循環；最后72℃再延伸10 min。擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增情況。選取部分陽性產物送生工生物工程股份有限公司進行測序，并將所得序列在NCBI網站（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）上進行Blast分析。

2 結 果

2.1 耐藥表型結果 對49株鴨疫里默氏菌菌株進行紅霉素、阿奇霉素2種藥物的藥敏試驗，結果表明（見表2），分離株對紅霉素、阿奇霉素的耐藥率很高，分別為100%、89.80%。

表2 菌株對大環內酯類藥物的敏感性

2.2 耐藥基因檢測結果 對49株鴨疫里默氏菌菌株進行ermA、ermB、ermC、ermF、ereD等5種耐藥基因的PCR擴增及部分測序，測序結果在NCBI上Blast分析，結果顯示，ermF基因擴增序列與GeneBank登錄的基因同源性達99%以上，ereD基因擴增序列與GeneBank登錄的基因同源性達98%以上，表明所擴增結果正確。

耐藥基因的檢測結果顯示，在49株鴨疫里默氏菌菌株中共檢測到2種耐藥基因，分別為ermF（見圖1）、ereD（見圖2），檢出率分別為85.71%（42/49）、91.84%（45/49），見表3。沒有檢測到ermA、ermB、ermC等3種耐藥基因。

圖1 鴨疫里默氏菌ermF耐藥基因PCR電泳圖

圖2 鴨疫里默氏菌ereD耐藥基因PCR電泳圖

表3 菌株大環內酯類藥物耐藥基因檢測結果

2.3 耐藥表型與耐藥基因型相關性分析 49株鴨疫里默氏菌菌株對大環內酯類的耐藥表型與耐藥基因型的結果比較（見表4），49株對紅霉素耐藥的鴨疫里默氏菌菌株中，85.71%菌株檢測到ermF耐藥基因，91.84%菌株檢測到ereD耐藥基因；44株對阿奇霉素耐藥的鴨疫里默氏菌菌株中，88.64%菌株檢測到ermF耐藥基因，95.45%菌株檢測到ereD耐藥基因；均未檢測到ermA、ermB、ermC等3種耐藥基因。可見，鴨疫里默氏菌菌株對大環內酯類藥物的耐藥表型與耐藥基因型的符合率比較高，在85.71%～95.45%。此外，在2株對阿奇霉素敏感的鴨疫里默氏菌菌株中檢測到ereD耐藥基因。

表4 49株鴨疫里默氏菌菌株大環內酯類藥物耐藥表型與耐藥基因型結果比較

3 討論

隨著細菌耐藥性的問題日益嚴重，其耐藥性檢測方法也變得至關重要。目前，臨床上檢測鴨疫里默氏菌耐藥性的常用方法是藥敏試驗，主要有K-B紙片法、肉湯稀釋法[1]、瓊脂稀釋法[12]等。K-B紙片法是應用最為廣泛的一種試驗方法，它操作簡單，無需特殊儀器，結果易于觀察。程龍飛等[2]用K-B紙片法對福建省及鄰近省份423株鴨疫里默氏菌分離株進行27種抗菌藥物的敏感性試驗，結果表明鴨疫里默氏菌分離株對多種藥物耐藥性很高，45%菌株對紅霉素耐藥。任曉梅等[3]用K-B紙片法對廣東省、山東省、江蘇省46株鴨疫里默氏菌分離株進行14種抗菌藥物的敏感性試驗，結果表明鴨疫里默氏菌分離株呈現廣譜耐藥性且有一定的區域性差異，89.1%菌株對紅霉素耐藥。朱元軍等[4]用K-B紙片法對我國南方地區120株鴨疫里默氏菌分離株進行16種抗菌藥物的敏感性試驗，結果表明鴨疫里默氏菌分離株中出現多重耐藥菌株，十一重耐藥菌株最多，75.8%菌株對紅霉素耐藥。本研究用K-B紙片法對莆田市49株番鴨源鴨疫里默氏菌菌株進行紅霉素和阿奇霉素的敏感性試驗，結果表明絕大部分菌株對紅霉素和阿奇霉素耐藥，耐藥率達89.80%以上。總體看，目前鴨疫里默氏菌菌株對紅霉素、阿奇霉素等大環內酯類藥物的耐藥性還是很高，臨床上應注意藥物的選擇和使用量。

藥敏試驗雖然是臨床上篩選敏感藥物和測定細菌耐藥性的有效方法，但存在測定時間長、操作復雜等缺點。而PCR技術具有時效快、靈敏度高、特異性強等優點，被廣泛應用于細菌的耐藥基因檢測[13-15]。楊芳芳[16]應用PCR技術首次在鴨疫里默氏菌中檢測到介導氨基糖苷類藥物耐藥的3種耐藥基因和介導喹諾酮類藥物低水平耐藥的2種耐藥基因。張亞楠[12]應用PCR技術在115株鴨疫里默氏菌菌株中檢測出25種耐藥基因。包濤濤等[17]應用PCR技術在6株鴨疫里默氏菌菌株中檢測出10種耐藥基因。本研究應用PCR技術在49株番鴨源鴨疫里默氏菌菌株中成功檢測到大環內酯類藥物的2種耐藥基因ermF、ereD，檢出率均比較高，分別為85.71%、91.84%，沒有檢測到ermA、ermB、ermC等3種耐藥基因。

Luo等[9]從全國不同地區分離得到的31%鴨疫里默氏菌菌株中檢測出ermF基因，并研究表明23S rRNA甲基轉移酶基因ermF介導的核糖體RNA修飾是引起鴨疫里默氏菌對大環內酯類藥物產生耐藥的主要原因。邢琳琳[1]研究也發現，ermF和ereD基因與鴨疫里默氏菌菌株的紅霉素抗性相關。張亞楠[12]應用PCR技術對115株鴨疫里默氏菌大環內酯類藥物耐藥基因檢測中，發現96.5%菌株攜帶ermF基因，確定ermF基因是引起鴨疫里默氏菌對紅霉素產生耐藥性的主要原因，還從中首次檢出ermB和ermC基因。本研究從49株對紅霉素和44株對阿奇霉素耐藥的鴨疫里默氏菌菌株中，85.71%以上菌株檢測出ermF、ereD兩種耐藥基因，在鴨疫里默氏菌大環內酯類藥物耐藥基因中占主導作用。據此推測，目前莆田市鴨疫里默氏菌對大環內酯類藥物耐藥的主要原因是由ermF和ereD耐藥基因介導的，與現有研究結果一致。此外，在2株對阿奇霉素敏感的鴨疫里默氏菌菌株中也檢測到ereD耐藥基因，推測其耐藥基因未表達。

4 結 論

本研究對49株鴨疫里默氏菌菌株進行了紅霉素、阿奇霉素2種藥物的藥敏試驗，結果表明，分離株對紅霉素、阿奇霉素的耐藥率很高，分別為100%、89.80%。莆田市鴨疫里默氏菌對大環內酯類藥物耐藥的主要原因是由ermF和ereD耐藥基因介導的。