紅肉火龍果HpCYP76AD1基因克隆與表達分析

鄭乾明，王小柯，馬玉華

(貴州省農業科學院果樹科學研究所，貴陽 550006)

【研究意義】紅肉火龍果果實色澤鮮艷，其含有的甜菜色素既能作為天然食用色素[1-2]，又具有淬滅自由基的活性，在抗氧化、抑制癌細胞及腫瘤細胞生長等具有應用價值[3-6]。紅肉火龍果果實中的甜菜色素主要為甜菜紅素和甜菜黃素，甜菜紅素是決定紅肉火龍果果實成熟時色澤的主要色素[7-9]。研究紅肉火龍果果實甜菜紅素的積累，分離代謝途徑關鍵基因，有利于闡明紅肉火龍果果實甜菜紅素積累的分子機制，對調控果實甜菜紅素含量，改良果實商品價值具有重要意義。【前人研究進展】甜菜紅素的生物合成以酪氨酸為前體，經過羥基化和氧化等形成重要的中間產物L-3,4-二羥基苯丙氨酸(L-DOPA)和甜菜醛氨酸[4,10-11]。最早在甜菜(Betavulgaris)中克隆獲得細胞色素P450家族成員BvCYP76AD1基因，其蛋白定位于細胞質和細胞核[12]，通過基因干涉表達和酵母異源表達研究均證明BvCYP76AD1介導L-DOPA生成cyclo-DOPA[13]。紫茉莉(Mirabilisjalapa)MjCYP76AD3是BvCYP76AD1的直系同源基因，其基因表達量與甜菜紅素含量顯著相關[14]。通過化學誘變劑處理，從藜麥(ChenopodiumquinoaWilld)分離CqCYP76AD1-1基因，其表達與下胚軸甜菜紅素積累有關，突變后喪失酶活性，甜菜紅素不積累[15]。近年來還發現，BvCYP76AD1介導酪氨酸羥基化形成L-DOPA，是甜菜紅素合成途徑中的第一個關鍵反應[16]。紅肉火龍果果實甜菜色素積累主要在授粉的24～28 d[17-20]。近年來發布火龍果基因組序列[21-22]，利用Illumina平臺的第二代高通量測序對果實進行轉錄組分析表明，CYP76AD1相關基因部分序列受轉錄因子HpWRKY44的轉錄激活調控[17, 23-24]。【本研究切入點】當前未有報道火龍果CYP76AD1基因的序列全長，不能開展基因功能等分析。因此，通過果實成熟期間轉錄組測序數據結合RT-PCR和測序，分離紅肉火龍果CYP76AD1相關基因?！緮M解決的關鍵問題】獲得火龍果HpCYP76AD1基因全長，分析其序列特征和基因表達模式，為明確其在果實甜菜紅素合成途徑中的生理功能奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

紅肉火龍果品種為“紫紅龍”，采集于貴州省安順市鎮寧縣的火龍果種植園。

1.2 方法

1.2.1 檢測樣品制備 將火龍果“紫紅龍”人工授粉當天記為0 d，于授粉的20，23，25，27和30 d采集火龍果果實樣品，每個時期采集9個果實，每3個果實為1次重復，共3次重復。取果肉切成厚度約0.5 cm的薄片，液氮速凍。所有樣品均在-80 ℃超低溫冰箱保存。

1.2.2 甜菜色素含量檢測 火龍果果肉甜菜紅素提取和含量檢測參考Hua等[17]的方法，果肉甜菜紅素相對含量利用分光光度計檢測。

1.2.3 RNA提取和轉錄組測序 利用Trizol試劑盒(Invitrogen，USA)提取火龍果果肉總RNA，使用瓊脂糖凝膠電泳和Nanodrop 2000分別檢測其質量和濃度。共計15份果肉樣品進行轉錄組高通量測序(數據未發表)，文庫構建、序列注釋和數據分析參見此前描述[25]。

1.2.4 RT-PCR擴增和測序 取1.0 μg合格樣品，利用RevertAid First Strand cDNA合成試劑盒(Fermentas，USA)合成cDNA第一鏈。使用Primer Premier 6軟件設計引物HpCYP76AD1-ORF-F和HpCYP76AD1-ORF-R(表1)用于RT-PCR擴增。以授粉30 d的果肉總RNA反轉錄合成的cDNA為PCR模板。擴增產物經電泳分離后回收，產物連接到克隆載體并轉化到大腸桿菌，挑取陽性克隆測序。

1.2.5 生物信息學分析 ORF預測使用ORF Finder程序(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)，理論等電點和相對分子量預測使用ExPASy程序(https://web.expasy.org/compute_pi/)。蛋白質二級結構預測使用PredictProtein(https://www.predictprotein.org)。利用Clustal W軟件進行序列比對，利用MEGA 6.0軟件構建基于鄰接法的系統進化樹，Bootstrap值進行1000次重復檢驗。

1.2.6 qRT-PCR檢測 根據HpCYP76AD1基因序列，使用Primer Premier 6軟件設計引物HpCYP76AD1-qRT-F和HpCYP76AD1-qRT-R(表1)。利用CFX ConnectTMReal-Time PCR檢測系統(Bio-Rad，USA)進行qRT-PCR檢測。反應體系總體積為20.0 μL，包括cDNA模板 1.0 μL，引物1.6 μL，SYBR Green PCR 混合體系(Applied Biosystems，USA)10.0 μL和ddH2O 7.4 μL。擴增程序如下：95 ℃變性3 min;5 ℃變性10 s，55 ℃退火20 s，72 ℃延伸 20 s，共40次循環。使用HpPTBP-F和HpPTBP-R作為內參基因(序列未發表)。基因相對表達量使用公式2-ΔΔCt計算，以授粉20 d的基因表達量設為“1”。

表1 HpCYP76AD1基因擴增和表達檢測的相關引物序列Table 1 Relative primer sequences for amplification and expression detection of HpCYP76AD1 gene

2 結果與分析

2.1 果實甜菜紅素含量

從圖1看出，授粉20～25 d火龍果果肉的甜菜紅素含量略有增加。授粉27 d后，甜菜紅素顯著積累；授粉30 d時甜菜紅素含量大幅度增加，含量約為20 d的150倍。

不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，下同Different lowercase letters indicate significant different at P<0.05 level. The same as below圖1 紅肉火龍果果實發育和成熟期間甜菜紅素的相對含量Fig.1 The relative content of betacyanin at development and ripening stages of H. polyrhizus fruits

2.2 HpCYP76AD1基因克隆

對紅肉火龍果果實發育至成熟的5個時期轉錄組測序分析，獲得1條長度為2577 bp的Unigene，與甜菜CYP76AD1基因編碼的氨基酸序列相似性為81%。該Unigene與前期報道的1個CYP76AD1相關Unigene(編號為c31181_g1)核苷酸序列[25]一致性為100%，說明兩者為同一基因。c31181_g1在果實中特異性表達，其表達量約是莖中的2000倍。該Unigene序列含有一條長度為1521 bp的ORF序列，編碼長度為506個氨基酸的蛋白質序列。設計RT-PCR引物擴增，然后克隆和測序獲得其ORF序列。

2.3 HpCYP76AD1蛋白序列

對HpCYP76AD1基因編碼的氨基酸序列進行預測，其理論等電點為8.86，相對分子量為57.5 kDa。將該序列在NCBI中再次進行blastx檢索發現，其與梨果仙人掌OfCYP76AD8的序列相似度最高，達89.96%(表2)。

表2 HpCYP76AD1與其他同源基因序列的相似性Table 2 Sequence similarity of HpCYP76AD1 and other homologous genes

將HpCYP76AD1與甜菜、紫茉莉和梨果仙人掌等相關基因，使用氨基酸序列構建基于鄰接法的系統進化樹(圖2)。上述基因明顯分為兩類，根據Sunnadeniya等[16]和Brockington等[26]對CYP76AD1家族成員的分類，HpCYP76AD1與梨果仙人掌OfCYP76AD8、紫茉莉MjCYP76AD3、甜菜BvCYP76AD1和紫色莧菜花AcCYP76AD2為α類，紫茉莉MjCYP76AD15、甜菜BvCYP76AD5和BvCYP76AD6為β類，HpCYP76AD1與來自仙人掌科梨果仙人掌的OfCYP76AD8親緣關系最近。

圖2 HpCYP76AD1與其他相關基因的系統進化樹Fig.2 Phylogenetic tree of HpCYP76AD1 and other related genes

2.4 HpCYP76AD1基因表達

從圖3看出，授粉20～25 d期間HpCYP76AD1基因表達量增加。授粉27 d的基因表達量約為授粉20 d的1500倍，此后到果實完全成熟(授粉30 d)的表達量約為授粉20 d的1650倍。利用qRT-PCR檢測的基因表達結果與RNA-seq結果基本一致。

圖3 紅肉火龍果HpCYP76AD1基因在果實成熟期間的相對表達量Fig.3 Expression pattern of HpCYP76AD1 gene of H. polyrhizus during fruit ripening

3 討 論

L-酪氨酸羥基化產生L-DOPA，以及L-DOPA羥基化產生cyclo-DOPA是甜菜色素合成途經中的兩個關鍵上游步驟。甜菜BvCYP76AD1基因于2012年首次克隆，在甜菜中干涉或超量表達該基因均影響甜菜紅素含量，通過酵母工程菌株表達驗證其介導L-DOPA羥基化產生cyclo-DOPA[13]。此后，進一步發現BvCYP76AD1、BvCYP76AD5和BvCYP76AD6均具有催化L-酪氨酸羥基化產生L-DOPA的活性，但BvCYP76AD5和BvCYP76AD6不能催化L-DOPA羥基化產生cyclo-DOPA[16]。系統進化分析表明，BvCYP76AD1、MjCYP76AD3和AcCYP76AD2屬于α類，BvCYP76AD5和BvCYP76AD6屬于β類。α和β類都具有催化L-酪氨酸羥基化產生L-DOPA的能力，存在功能冗余。同時α類在進化中又產生催化L-DOPA羥基化形成cyclo-DOPA的能力。本研究獲得的紅肉火龍果HpCYP76AD1屬于α類，因此具有上述2個羥基化反應的能力。

CYP76AD1基因的表達與甜菜紅素含量呈現明顯的正相關關系。紫茉莉不同發育時期的花被中，甜菜紅素含量隨CYP76AD3基因上調表達明顯增加[14]。藜麥下胚軸中經光照刺激產生甜菜紅素，CYP76AD1-1基因大量表達，說明CYP76AD1-1基因與甜菜紅素積累密切相關[15]。紅肉火龍果果實在成熟過程中甜菜紅素大量積累，HpCYP76AD1基因在果實特異表達，且隨果實成熟顯著上調，說明甜菜HpCYP76AD1基因參與果實甜菜紅素積累。下一步需要驗證其催化活性及調控機制，為明確火龍果果實甜菜紅素積累分子機制和改善果實品質奠定基礎。

4 結 論

克隆紅肉火龍果細胞色素P450家族成員HpCYP76AD1基因全長序列與甜菜BvCYP76AD1同屬于α類，推測其在甜菜色素合成的兩個上游羥基化反應中發揮重要功能。HpCYP76AD1基因在果實成熟期間大幅上調表達，參與果實成熟期間的甜菜紅素積累。