番茄泛素結合酶變體基因鑒定及表達分析

趙秋芳，馬海洋，馬智玲，魏長賓，陳 曙

(1.中國熱帶農業科學院南亞熱帶作物研究所，廣東 湛江 524091；2.海南省熱帶作物營養重點實驗室，廣東 湛江 524091；3.農業農村部熱帶果樹生物學重點實驗室，廣東 湛江 524091)

【研究意義】番茄為茄科番茄屬一年生或多年生蔬菜作物，富含維生素、胡蘿卜素及番茄紅素等營養物質，是我國重要的蔬菜作物，同時也是研究果實成熟和植物逆境脅迫的模式植物。番茄在生長過程中常受到不利生長環境的影響，如病原微生物侵染、干旱、鹽、高溫、冷害等生物和非生物脅迫，對番茄生產造成嚴重危害。前期研究表明泛素結合酶變體(UEV)參與DNA損傷，激素信號和非生物脅迫等多種生物學功能。對番茄UEV家族基因進行全面的生物信息學、組織特異性表達及非生物脅迫條件下的表達進行分析，有利于深入了解UEV家族基因的功能，并對番茄抗逆基因挖掘和抗逆育種具有重要意義。【前人研究進展】泛素是一種含有76種氨基酸的小分子蛋白，在真核生物中高度保守[1]。蛋白泛素化是指泛素分子在一系列特殊的酶作用下，將細胞內的蛋白質分類，從中選出靶蛋白，并對靶蛋白進行特異性修飾的過程。蛋白泛素化過程主要通過泛素活化酶(E1，Ub-activating enzyme，UBA)、泛素結合酶(E2，Ub-conjugating enzyme，UBC)和泛素連接酶(E3，Ub-ligase)三種酶來實現[2]。Lys48泛素鏈是26s蛋白酶體降解途徑中起靶向作用的主要類型[3]。Lys63泛素鏈是第二種豐富的形式，其作用主要作為信號靶向蛋白質[4]。UBC13是目前已知的參與催化目標蛋白形成非典型的Lys63-linked的多聚合泛素鏈的E2蛋白，而這一過程的實現必須依賴于一個UEV與UBC13形成異質二聚體[5-6]。在擬南芥中，UBC13基因參與了DNA損傷[7]、頂端優勢[8]、鐵代謝[9]、免疫[10]、生長素信號[11]、響應低溫和病原菌侵害[12]，而這些過程必須依賴UEV蛋白來實現，因此UEV參與許多重要的生命過程，具有重要的意義。UEV(Ubiqutin E2 enzyme variants)蛋白在序列和結構上與E2s相似，也存在150個左右的氨基酸組成的保守UBC結構域，但是缺少半胱氨酸活性催化位點[13]，因此作用與E2s有所不同。在酵母和動物中，UEV1在DNA損傷修復，激酶活化和識別等許多生物過程中具有重要作用[5,14]。第一個被鑒定的UEV1基因是在酵母芽細胞中被鑒定出來的MMS2，MMS2參與酵母的DNA損傷[15]。單細胞真核生物基因組只有一個UBC13和UEV基因[15]，而高等真核生物基因組通常包含多個UBC13和UEV的同源基因，表明它們可能賦予不同的生物學功能[16-18]。擬南芥中有4個UEV1基因，4個基因均可以補充酵母mms2缺失突變體，而UEV1D缺失植株對DNA損傷劑的耐受性大大降低[16]。水稻中存在4個UEV1基因，OsUEV1s的表達能夠拯救酵母mms2突變體，使其免于DNA損傷劑造成的死亡[17]。短柄草存在3個UEV1基因，3個BdUEV1s可與BdUBC13s結合，在體外催化Lys63-linked多聚泛素化，而且能在功能上彌補mms2酵母突變體DNA損傷耐受中的缺陷[18]。COP10是植物中研究較為清楚的UEV蛋白，研究發現COP10作為植物光形態建成的負調控因子，通過與DNA損傷結合蛋白DET1和DDB1相互結合形成復合物COP10-DET1-DDB1，催化關鍵光形態建成轉錄因子HY5的降解，進而參與調控擬南芥葉片的感光性及光周期過程[19-20]。【本研究切入點】UEV作為植物中特殊的E2-like蛋白，在植物DNA損傷，光形態建成等方面發揮重要作用。番茄作為重要的蔬菜和模式植物，其有關UEV基因的研究尚未見報道。【擬解決的關鍵問題】本研究從番茄基因組鑒定SlUEV基因，分析其理化性質、基因結構、保守結構、進化關系，明確其組織表達差異及其在高鹽、干旱、高溫和低溫脅迫下的表達模式，以期為研究SlUEV基因功能和抗逆調控作用奠定基礎，同時也為番茄抗逆基因挖掘和抗逆育種提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 番茄材料 試驗所用番茄品種為Heinz 1706，種子由中國科學院遺傳與發育生物學研究所提供。

1.1.2 組織樣品采集 在番茄開花后，分別采集根、莖、葉、花樣品，液氮速凍后，-80 ℃保存備用。分別在花后30、40、46和50 d采集番茄幼果、綠熟果、轉色果、紅熟果放入液氮速凍后，-80 ℃保存備用。

1.1.3 番茄非生物脅迫處理 番茄種子采用10%次氯酸鈉溶液消毒10 min，用無菌蒸餾水沖洗5次，放在無菌濾紙上，25 ℃的黑暗中發芽4 d。種子萌發后，在直徑13.5 cm的塑料盆中珍珠巖基質種植，在(28±2)℃、光照14 h、暗10 h的溫室中生長2周后，選取生長一致的幼苗進行脅迫處理。干旱脅迫：將幼苗放置在15% PEG 6000溶液培養；高鹽脅迫：將幼苗放置在200 mmol/L NaCl溶液培養；低溫脅迫：將幼苗放置在4 ℃培養箱培養；高溫脅迫：將幼苗放置在37 ℃培養；無處理幼苗作為對照。分別在處理0、1、6、24 h后采集樣品。所有采集樣品用液氮速凍，-80 ℃保存備用。

1.2 試驗方法

1.2.1 番茄UEV基因的鑒定 擬南芥全基因組數據庫(TAIP)中8個擬南芥UEV蛋白序列為探針，在番茄基因組數據庫(https://solgenomics.net/)和Phytozome12.0(https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html)blastn番茄UEV基因候選成員，并利用SMART對候選基因進行保守結構域檢驗，具備UBCc結構域且不存在半胱氨酸活性位點的蛋白確認為番茄UEV蛋白，同時在Phytozome12.0(https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html)獲得其CDS、氨基酸序列及染色體位置等信息。

1.2.2 番茄UEV基因的生物信息學分析 利用GSDS 2.0(http://gsds.cbi.pku.edu.cn/)在線工具繪制番茄UEV基因結構圖，分析其外顯子和內含子結構。運用在線工具Plant-mPloc(http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/plant-multi/)對番茄UEV蛋白進行亞細胞定位。利用SMART(http://smart.embl-heidelberg.de/)分析番茄UEV蛋白的保守結構域，并用TBtools繪圖。利用MEME(http://meme-suite.org/tools/meme)在線工具對番茄UEV蛋白的保守基序進行預測，參數中預測數目設置為5，長度設置為6～50，其他參數均為默認設置。利用ClustalX(1.83)將擬南芥和番茄UEV蛋白序列進行同源序列比對，并利用MEGA 6.0軟件，采用相鄰連接法(Neighbor-Joining，NJ)構建擬南芥、番茄UEV蛋白的系統進化樹，校驗參數Bootstrap重復為1000次，其他參數均為默認值。

1.2.3 番茄UEV基因的表達 采用植物RNA提取試劑盒(華越洋生物科技有限公司產品)提取番茄不同組織及脅迫處理樣品的總RNA，樣品RNA經檢測質量和濃度后，利用M-MLV(Rnase H-)逆轉錄酶(TaKaRa公司)反轉錄得到cDNA模板，稀釋備用。番茄UEV基因引物采用Primer Premier 5.0軟件進行設計，實驗所用引物由廣州艾基生物技術有限公司合成，引物序列信息詳見表1。實時熒光定量PCR反應在Roche LightCycler480中進行，實時熒光定量PCR試劑盒為SYBR Green Realtime PCR Master mix(TaKaRa公司)，反應體系及反應程序詳見參考文獻[21]。番茄UEV基因的相對表達量采用2-ΔΔCt方法進行計算，表達量上調2倍或者下調1/2以上認為存在差異表達[22]。

表1 番茄UEV基因實時熒光定量PCR引物Table 1 Primer sequences used in quantitative real-time PCR analysis of UEV genes of tomato

2 結果與分析

2.1 番茄UEV基因鑒定

根據序列比對，篩選到5個番茄UEV基因，根據其在染色體上的位置分別命名為SlUEV1～SlUEV5(表2)。其中SlUEV1，SlUEV2，SlUEV3分布在1號染色體上，SlUEV4分布在4號染色體，SlUEV5分布在10號染色體。SlUEV的CDS長度在441～855 bp，氨基酸數目在146～284 aa，分子量在16.20～33.14 kD，等電點在5.12～8.52，亞細胞定位預測結果表明SlUEV均定位于細胞核中。基因結構分析發現SlUEV1、SlUEV2、SlUEV5均含有4個外顯子，SlUEV4包含5個外顯子，而SlUEV3僅含有1個外顯子(圖1)。

表2 番茄UEV基因的序列信息Table 2 Sequence information of UEV genes in tomato

圖1 番茄UEV基因結構Fig.1 Structure of UEV genes in tomato

2.2 番茄UEV進化樹及蛋白結構域分析

對2個酵母UEV蛋白、8個擬南芥UEV蛋白和5個番茄UEV蛋白構建系統進化樹(圖2)，結果表明SlUEV1與擬南芥AtCOP10為同源蛋白，屬于COP10亞家族。SlUEV2、SlUEV5、SlUEV4屬于UEV1亞家族，其中SlUEV2和SlUEV5相似度較高，且與AtUEV1C和AtUEV1D為同源蛋白；SlUEV4與AtUEV1A和AtUEV1B聚在一起，同源性高。SlUEV3屬于單個分枝，說明植物UEV家族在單子葉和雙子葉植物中有所不同。

圖2 番茄、酵母和擬南芥UEV蛋白進化樹Fig.2 Phylogenetic tree of UEV proteins in tomato, yeast and Arabidopsis thaliana

前人研究表明泛素結合酶E2蛋白均擁有一個高度保守的UBCc結構域，N端和C端的大小和結構上存在很大差別，根據是否具有N端和C端延長鏈，將E2s蛋白分4大亞類，ClassⅠ僅含有UBC/UEV結構域，ClassⅡ包含UBC/UEV結構域和C端延長的蛋白序列，ClassⅢ包含UBC/UEV結構域和N端延長的蛋白序列，ClassⅣ包含UBC/UEV結構域、N端和C端延長的蛋白序列[23]。番茄UEV蛋白的UBCc保守結構域如圖3所示，其中SlUEV1屬于ClassⅡ家族，SlUEV2、SlUEV4、SlUEV5均屬于ClassⅠ家族，SlUEV3屬于ClassⅣ家族。與擬南芥的UBCc保守結構域比較發現，同一進化樹分枝中的UBCc位置相似，均屬于相同亞家族，這也說明UEV家族的進化過程中非常保守。保守基序分析發現：SlUEV2、SlUEV4、SlUEV5存在保守基序數目和分布也非常相似，均存在保守基序1、2、3，另外SlUEV4還存在保守基序5。SlUEV1存在保守基序1和4，SlUEV3存在保守基序1、4、5(圖4)。

圖3 番茄和擬南芥UEV蛋白的UBCc保守結構域Fig.3 The UBCc conserved protein domain of UEV proteins in Arabidopsis and tomato.

圖4 番茄UEV蛋白保守基序Fig.4 Motif of UEV proteins in tomato

2.3 番茄UEV基因組織表達

5個SlUEV基因在番茄不同組織中的表達模式有差異(圖5)。其中SlUEV1在番茄莖中的表達量最高，在根中表達量較低，另外SlUEV1在花和果實發育期的表達量也較高。SlUEV3在花中的表達量最高，在花中特異表達，預示其可能在番茄花發育過程中發揮作用，且SlUEV3在番茄果實成熟過程中表現表達差異，在紅熟果中的表達量顯著增加，預示其可能在果實成熟中發揮作用。SlUEV4在番茄果實成熟的各個階段均有較高表達量，預示SlUEV4可能參與番茄果實的發育過程。SlUEV2和SlUEV5在番茄不同組織間無差異表達，呈現組成性表達。

R：根；St：莖；L：葉；F：花；Y：小果，MG：綠果；Br：轉色果，RR：紅熟果R: Root; St: Stem; L: Leaf; F: Flower; Y: Young fruits; MG: Green fruits; Br: Breaker fruits; RR: Red ripe fruits圖5 番茄UEV基因在番茄不同組織部位的表達Fig.5 Differential expression levels of UEV genes in different tissues of tomato

2.4 番茄UEV基因在非生物脅迫下的表達

對番茄幼苗進行高鹽、干旱、低溫、高溫的非生物脅迫試驗，結果(圖6)表明：番茄UEV基因對干旱處理的響應最為敏感，其中SlUEV1的表達量在干旱處理6和24 h分別為0 h的5.5和4.4倍；SlUEV2的表達量在干旱處理6 h為0 h的2.74倍；隨著干旱處理時間的延長，SlUEV3的表達量呈上升趨勢，在干旱處理1、6、24 h分別為0 h的3.40、6.02、7.87倍。SlUEV5在干旱處理6 h的表達量為0 h的2.38倍，而干旱處理下，SlUEV4基因的表達量無差異。鹽脅迫下SlUEV1表達量無差異，而SlUEV2和SlUEV5分別在鹽脅迫處理6 h出現下調表達，SlUEV3和SlUEV4分別在鹽脅迫處理24 h時出現上調表達。冷脅迫處理下SlUEV1和SlUEV3基因的表達量呈現先升高后降低的趨勢，但是與0 h的表達量相比無差異；SlUEV2和SlUEV5在冷脅迫下基因表達無差異；冷脅迫下SlUEV4基因的表達量呈現先升高后降低的趨勢，且在1 h表達量為0 h的2.05倍，呈差異表達。高溫脅迫條件下SlUEV2、SlUEV4和SlUEV5表達量呈現下降趨勢，且在24 h表達量最低，差異均在2倍以上，呈差異表達。SlUEV3表達量在高溫脅迫下有略微升高，但與0 h的表達量無差異。SlUEV1表達量在高溫脅迫24 h下降至0 h的0.44倍，呈差異表達。

圖6 番茄 UEV 基因在高鹽、干旱、低溫和高溫脅迫下的表達分析Fig.6 Analysis of expression levels of the UEV genes in tomato under salt, drought, cold and heat stresses

3 討 論

泛素結合酶變體(UEV)蛋白在性質和結構上與泛素結合酶(E2)相似，但由于缺乏催化的半胱氨酸殘基，它們無法與泛素形成硫醇酯鍵連接，因此其在生物體中的作用也與E2不同。研究表明UEV與UBC13組成形成穩定的異源二聚體來介導Lys63-linked多聚泛素化。單細胞真核生物基因組通常包含單個UEV基因，而在高等植物中發現了多種同源基因，且在不同物種中的UEV基因數目存在差異。在酵母中僅存在1個UEV基因，而在擬南芥和水稻中存在8個UEV基因，其中4個UEV基因可以與UBC13形成穩定的異源二聚體。高粱[24]和龍眼[22]和可可[25]中分別存在7、3和6個UEV基因。本研究從番茄中鑒定到5個UEV基因，進化樹分析可以分為3類，SlUEV2、SlUEV5、SlUEV1屬于UEV1亞家族，且SlUEV2、SlUEV5間的同源性較高，其保守結構域和保守基序也相似。SlUEV4屬于COP10亞家族，SlUEV3與擬南芥的UEV蛋白并未聚在一起，表明植物UEV家族在單子葉和雙子葉植物中有所不同。

基因在不同組織的表達模式影響基因功能的發揮。水稻中OsUEV1B和OsUEV1C在不同組織中的表達水平較高且較為一致，OsUEV1A轉錄水平較低，且表達量在各部位較為一致。OsUEV1D在不同組織中的表達差異較大，其中OsUEV1D在葉片的各部位表達量高，但在花粉和精子細胞中的表達量較低[17]。雙穗短柄草中存在3個UEV1基因，組織表達分析發現BdUEV1C在2周大的葉片(L2)和8周大的穗(SP8)中的表達量增加，而BdUEV1A和BdUEV1B的表達量在各組織間呈組成型表達，表達量較為一致[18]。番茄UEV基因組織表達分析發現5個SlUEV基因在不同組織的表達量存在差異，SlUEV1在番茄莖中的表達量最高，而SlUEV3在花中的表達量最高，SlUEV4在果實發育期的表達量明顯高于其他生育時期，SlUEV2、SlUEV5屬于同源基因，它們在番茄不同組織中呈現組成性表達。綜上所述番茄UEV基因可能在番茄組織的不同發育時期起到不同的調節作用。

植物由于它們的固著性，不斷地受到不同類型的脅迫，如紫外線照射下的DNA損傷、鹽和干旱脅迫等，這些脅迫嚴重損害植物的生存，降低作物產量。研究表明：UEV基因參與泛素化過程，而泛素化過程往往與植物的應激反應有關。前期研究表明UEV可以應答非生物脅迫，但是在不同作物中UEV基因對非生物脅迫的應答模式不盡相同。如Jia等[24]發現高粱中存在7個UEV基因，分別命名為SbUBC2、SbUBC12、SbUBC14、SbUBC29、SbUBC32、SbUBC37、SbUBC40。其中SbUBC2、SbUBC12、SbUBC14在鹽脅迫下顯著上調表達，SbUBC29、SbUBC40在干旱處理下顯著下調，SbUBC2、SbUBC14在干旱處理下顯著上調，其中SbUBC40在鹽脅迫和干旱脅迫處理下表達量均上調10倍以上，表明SbUBC40可以強烈響應干旱和鹽脅迫。Jue等[22]研究發現龍眼中僅存在3個UEV基因，命名為DlUBC4、DlUBC6、DlUBC9，其中DlUBC6在非生物脅迫下表達量無顯著變化，而DlUBC4、DlUBC9在高溫處理下顯著上調表達，而對冷脅迫無明顯應答。非生物脅迫處理發現3個雙穗短柄草BdUEV1基因表達量均受冷脅迫誘導上調表達，而高溫和干旱脅迫下BdUEV1的表達量顯著上調，暗示該基因受高溫和干旱脅迫誘導[17]。本研究結果表明：番茄UEV基因對干旱脅迫較為敏感，干旱脅迫時SlUEV1、SlUEV2、SlUEV3和SlUEV5均顯著上調表達，而SlUEV4在干旱脅迫下無顯著變化，說明番茄UEV基因表達受干旱脅迫誘導。而高溫和低溫脅迫下，UEV基因表達量變化較小，表明番茄UEV基因可能不響應環境中的溫度變化。SlUEV2、SlUEV5高鹽脅迫下在6 h時顯著下調表達，表明這些基因對鹽脅迫負響應。

4 結 論

從番茄基因組數據庫中鑒定到5個UEV家族基因，分別分布在1、4、10三條染色體上，系統進化樹分析將其分為3個亞家族。多個SlUEV基因在番茄不同組織表達存在差異。SlUEV1，SlUEV2，SlUEV3和SlUEV5基因受干旱脅迫誘導上調表達，推測其在番茄適應干旱脅迫過程中起著重要作用，對SlUEV2、SlUEV5高鹽脅迫時顯著下調表達，推測其負調控番茄鹽脅迫，對溫度脅迫響應較小。本研究為深入開展SlUEV基因在植物生長和逆境脅迫響應中的功能研究提供理論基礎。