葉面噴施鈣、鎂肥對‘妃子笑’荔枝果肉有機酸跨膜運輸的影響

廖海枝，林曉凱，楊成坤，杜婧加，彭俊杰，周開兵

(1. 熱帶作物新品種選育教育部工程研究中心，海口 570228; 2. 海南大學園藝學院, 海口 570228)

【研究意義】荔枝(LitchichinensisSonn.)為無患子科常綠喬木，與香蕉、菠蘿、龍眼一同號稱“南國四大果品”，其在華南區具有重要的經濟和社會效益[1]。其中，‘妃子笑’荔枝(LitchichinensisSonn. cv. Feizixiao)是我國荔枝主栽品種之一，是海南產區栽培面積最大和總產量最高的品種[2]，其提質增效栽培是海南省荔枝產業可持續發展的必然途徑，因此必須開展荔枝果實品質發育研究。‘妃子笑’荔枝果肉富含蘋果酸、酒石酸、草酸、檸檬酸等多種有機酸組分[3]，荔枝果實風味品質正是由糖和有機酸的組分與含量影響的[4]，然而植物果實有機酸的積累與有機酸的跨膜運輸有關[5]，目前關于‘妃子笑’荔枝果實的有機酸代謝及其生理機制問題的研究報道較少，因此有必要著手研究荔枝果肉有機酸跨膜運輸問題，以期為荔枝的提質增效栽培提供理論依據。【前人研究進展】植物果實有機酸代謝很復雜，有機酸參與糖酵解反應、三羧酸循環、糖異生作用等途徑[6]。有機酸在代謝中也存在液泡膜的跨膜運輸問題，其關鍵酶主要包括ATP酶(H+-ATPase)和焦磷酸酶(V-PPase)等兩個酶[7]。植物液泡膜H+-ATPase和液泡膜V-PPase是液泡膜上含量豐富的兩個蛋白，在植物的正常生長和脅迫條件下起到重要作用[8-9]。前人報道，液泡膜H+-ATPase和V-PPase等2種類型的質子泵會影響果實液泡有機酸的貯藏[9]。跨膜運輸和分解可能會影響檸檬酸積累[10]。檸檬酸的轉運需要質子流的流動，液泡膜上的的H+-ATPase和V-PPase負責調節，保持液泡內的酸度pH，防止液泡被堿化[11]。【本研究切入點】果實中的質子泵基因密切影響著有機酸含量，尤其是蘋果酸和檸檬酸[12]。有機酸轉運過程可能影響有機酸含量，此外，營養元素如鉀、氮、磷等也會對果實酸度有較大影響[12-13]。【擬解決的關鍵問題】基于課題組前期已明確葉面噴鈣鎂混合肥處理能緩解妃子笑荔枝果肉“退糖”現象[14]，本文通過在‘妃子笑’荔枝樹冠上噴施鈣、鎂肥對其進行處理來探討不同處理是否對‘妃子笑’荔枝果實有機酸跨膜運輸存在影響，進而了解是否引起有機酸積累而影響果肉呼吸作用，從而緩解果肉“退糖”現象，也為果實有機酸代謝研究提供一定理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗地點位于海南省臨高縣金牌農場五隊荔枝園，地形為瓊北臺地，屬于熱帶季風氣候區，年平均溫23～24 ℃，年平均日照時數2175 h，年平均降雨量1100～1800 mm，且雨熱同季；土壤為肥沃磚紅壤。在該果園選取長勢一致、無病蟲害的20株16年生‘妃子笑’荔枝樹作為試驗材料。花期為2—3月，生理落果期為4月初開始，4月下旬進入果實膨大期，5月中旬進入果實成熟期，試驗于4月下旬開始進行葉面噴肥處理。

1.2 試驗設計方法

對樹冠進行葉面噴肥處理，即以葉面噴施0.3%氯化鈣水溶液(Ca)、0.3%氯化鎂水溶液(Mg)、0.3%氯化鈣和0.3%氯化鎂混合水溶液(Ca+Mg)等為處理，以葉面噴施同等體積的清水為對照(CK)。單株小區，5次重復。

1.3 取樣與樣品處理方法

在第一次處理前，先在樹冠中部外圍四方選擇生長健壯、大小中等的果實作為以后取樣的參照果，并掛牌標記。葉面噴肥處理時間分別于謝花后35、42、50 d(9: 00—10: 00 am)，每次施肥處理前對各單株按照取樣參照果大小取好樣果；此后分別繼續于謝花期后56、63、69和73 d對各單株分別按照取樣參照果大小、著色狀態取果樣；每次對各單株取樣果30個，取好樣果后立刻速凍于液氮罐，并于實驗室超低溫冰箱(-80 ℃)中儲存。

1.4 試驗指標及其測定方法

有機酸含量測定：有機酸標樣包括蘋果酸、酒石酸、檸檬酸、草酸和琥珀酸等，由北京壇墨質檢科技有限公司出產。參考胡志群等[15]與王芮東[16]等方法并略有改動，采用高效液相色譜法鑒定和檢測上述單體有機酸種類和含量。稱取1 g荔枝果肉，用0.2%的偏磷酸冰浴研磨，超聲20 min后10 000 r/min離心15 min，使用濾膜(0.45 μm)過濾上清液后待測。流動相為用磷酸調節pH至2.8的0.1%的磷酸二氫鈉溶液，流速為0.6 mL/min，柱溫為室溫，波長210 nm，進樣量10 μm。

跨膜運輸酶活性測定：使用江蘇科特生物公司試劑盒測定H+-ATPase和V-PPase兩種跨膜運輸酶活性，依據產品說明書介紹的雙抗體夾心法進行測定。具體方法參考馬俊興等人在牦牛肺上的研究方法[17]。

水溶性鈣、鎂含量測定：稱取1 g荔枝果肉，烘干至恒重，加入去離子水研磨至勻漿，震蕩過夜后采用火焰原子吸收法測定水溶性鈣、水溶性鎂含量[18]。

使用儀器：配有VWD紫外檢測器的高效液相色譜儀(型號：ALLianceE26954)，5 μm色譜柱(型號：SinoChromODS-BP，Nucleodur 250 mm×4.6 mm)，原子吸收分光光度計(型號：NOVAA400P)，離心機，酶標儀，震蕩培養箱等。

1.5 數據統計分析方法

采用SAS軟件進行數據統計分析，分別采用ANOVA過程、DUNCAN法和REG過程作方差分析、多重比較分析、多元線性相關分析。

2 結果與分析

2.1 有機酸含量動態變化

2.1.1 草酸 不同處理和CK的草酸含量動態變化趨勢和同一時間點不同處理之間均具有明顯的差異(圖1-A)。CK、Mg和Ca+Mg處理經歷兩次“上升、下降”交替過程，隨后CK和Ca+Mg處理再次上升，之后CK維持穩定，Ca+Mg處理則下降；Ca處理表現為“上升、下降、平緩、上升、下降”的變化趨勢。在花后42 d，Ca處理顯著最高，Ca+Mg處理顯著低于CK；在花后50 d，Mg和Ca處理顯著低于CK；在花后56 d，Ca和Ca+Mg處理顯著低于CK；在花后63 d，CK和Ca+Mg處理顯著低于Mg和Ca處理，Ca處理顯著低于Mg處理；在花后69 d，CK和Mg處理顯著低于Ca和Ca+Mg處理，Ca處理顯著低于Ca+Mg處理；在花后73 d，Mg處理顯著最低。可見，CK果肉草酸含量在前期處于較高水平，在后期則低于Ca、Mg和Ca+Mg處理，說明不同處理在前期抑制果肉草酸積累，在后期則反之。

2.1.2 酒石酸 不同處理和CK的酒石酸含量動態變化趨勢基本一致，在某些時間點不同處理間存在明顯差異(圖1-B)。不同處理和CK在初始時相對穩定，在花后50 d迅速上升后下降。在花后42 d，Mg處理顯著最低，其余處理與CK間均無顯著差異；在花后56 d，Ca處理顯著低于Ca+Mg處理；在花后69 d，CK和Mg處理顯著低于Ca和Ca+Mg處理；在花后73 d，Mg處理顯著低于Ca處理；除上述顯著差異外，不同處理和CK在果肉酒石酸含量上均無顯著差異。可見，在果肉酒石酸含量上，CK呈低于Ca和Ca+Mg處理趨勢，而呈高于Mg處理趨勢，說明Ca和Ca+Mg處理呈促進酒石酸積累的趨勢，而Mg處理則反之。

2.1.3 蘋果酸 不同處理和CK的果肉蘋果酸含量具有一致的“L”型動態變化趨勢，均先急劇下降至花后50 d，隨后趨于穩定；在某些時間點不同處理間則存在顯著差異(圖2-A)。在花后42 d，CK顯著最低，Ca處理顯著低于Mg處理；在花后73 d，CK和Mg處理顯著低于Ca處理；除上述顯著差異外，不同處理和CK間均無顯著差異。可見，前期的所有處理呈促進蘋果酸積累的趨勢，僅Ca處理促進后期蘋果酸的積累。

2.1.4 檸檬酸 不同處理和CK的檸檬酸含量的動態變化均呈“M”型趨勢，在同一時間點不同處理間則存在明顯差異(圖2-B)。在花后42 d，Ca處理顯著最低，CK和Mg處理顯著高于Ca+Mg處理；在花后50～63 d，CK均最低，除了在56 d時與Ca處理無明顯差異外，均顯著低于其余3個處理；在花后50和56 d，Ca處理顯著低于Mg和Ca+Mg處理；在花后63 d，Ca+Mg處理顯著低于Ca和Mg處理；在花后69 d，CK顯著低于Ca+Mg處理，Mg處理明顯最低；在花后73 d，Ca+Mg處理顯著最高，CK和Mg處理明顯低于Ca處理。可見，CK持續處于較低水平，Ca和Ca+Mg處理可提高檸檬酸含量，Mg處理則呈先促進、后抑制的趨勢。

圖2 不同處理下蘋果酸和檸檬酸的含量變化Fig.2 The content changes of malic acid and citric acid under different treatments

2.2 有機酸跨膜運輸酶活性動態變化

2.2.1 H+-ATPaseV 不同處理和CK的果肉H+-ATPase活性具有不同的變化趨勢，且在同一時間點不同處理間也存在明顯差異(圖3-A)。CK經歷3次的“下降、上升”交替；Mg處理經歷3次“上升、下降”交替；Ca處理先無明顯變化，隨后呈“下降、上升、平緩”的趨勢；Ca+Mg處理先下降，隨后保持穩定，再經歷2次“上升、下降”交替過程。在花后42 d，CK和Ca+Mg處理顯著低于Mg和Ca處理；在花后50 d，CK顯著最高；在花后56 d，Ca處理顯著低于CK和其余處理；在花后63 d，CK、Ca、Mg、Ca+Mg處理依次降低，且任意兩者間均顯著；在花后73 d，亦為任意兩者間均顯著，由高至低排序為Ca、Ca+Mg、Mg處理。可見，CK的高峰與其余處理相反，且69～73 d，唯有CK顯著上升，表明不同處理呈抑制果肉H+-ATPase活性的趨勢。

2.2.2 V-P Pase酶 不同處理和CK的果肉V-PPase酶活性具有不同的變化趨勢，在同一時間點不同處理間也存在明顯差異(圖3-B)。CK和Ca處理經歷兩次“下降、上升”交替過程后又下降；Mg和Ca+Mg處理呈“下降、上升、下降、平緩”趨勢。在花后42 d，Ca+Mg處理顯著最低；在花后50、63、69 d，CK均顯著高于其余處理，在50 d時，按CK、Ca、Mg、Ca+Mg處理排序依次降低，且任意兩者間均顯著，在63 d時，Ca+Mg處理顯著高于Ca處理，69 d時，Ca處理顯著高于Mg和Ca+Mg處理；在花后56 d，Mg和CK顯著高于Ca和Ca+Mg處理，Mg處理又顯著高于CK；在花后73 d，CK和Ca處理顯著高于Mg和Ca+Mg處理。可見，CK除在56 d時低于Mg處理外，全程高于其余處理，說明所有處理呈抑制果肉的V-PPase酶活性的趨勢。

圖3 不同處理下H+-ATP和V-PPase的活性動態變化Fig.3 Dynamic changes of H+-ATP and V-PPase activities under different treatments

2.3 水溶性鈣、鎂含量動態變化

2.3.1 水溶性鈣 不同處理和CK的水溶性鈣含量在動態變化趨勢和同一時間點上均具有明顯差異(圖4-A)。花后63 d前不同處理和CK的水溶性鈣含量均上升，隨后CK和Ca處理持續上升，Mg處理繼續上升后下降，Ca+Mg處理保持平緩。在花后42 d，各處理間均差異顯著，排序從高到低為Ca、Mg、CK、Ca+Mg處理；在花后50～69 d，除63 d外，Mg處理均為顯著最高；在花后50和56 d，CK和Ca處理均顯著高于Ca+Mg處理；在花后63和73 d，分別為Ca和Ca+Mg處理顯著最低。可見，Mg處理高于CK和其余處理，Ca+Mg處理則持續低于CK和Mg處理，表明Mg處理表現出促進水溶性鈣含量積累的趨勢，Ca+Mg處理則反之，CK、Mg和Ca+Mg處理在73 d后被Ca處理超越。

2.3.2 水溶性鎂 不同處理和CK的水溶性鎂含量的動態變化趨勢和同一時間點均差異明顯(圖4-B)。所有處理和CK先上升再下降，隨后CK維持穩定，Mg處理上升再下降，Ca處理持續上升，Ca+Mg處理保持穩定后降低。在花后42 d，CK顯著高于Mg、Ca和Ca+Mg處理，Mg和Ca處理均顯著高于Ca+Mg處理；在花后50～56 d，CK和Ca+Mg處理均顯著低于Ca處理；在花后50 d，Ca處理還顯著低于Mg處理；在花后63 d，Mg和Ca處理顯著低于CK和Ca+Mg處理；在花后73 d，Ca處理顯著最高，CK顯著高于Ca+Mg處理。可見，水溶性鎂含量會被Mg和Ca處理所提高，Ca+Mg處理則反之。

圖4 不同處理下水溶性鈣和水溶性鎂的含量動態變化Fig.4 The content changes of water-soluble calcium and water-soluble magnesium under different treatments

2.4 有關指標間多元線性相關性分析

2.4.1 不同有機酸含量與兩種酶活性 由表1可見，CK的H+-ATPase活性與草酸、蘋果酸、檸檬酸等含量的偏相關系數呈負相關；Mg處理H+-ATPase活性與蘋果酸含量的偏相關系數呈正相關；Ca處理的H+-ATPase活性與4種有機酸含量的偏相關系數均呈正相關，V-PPase活性與草酸含量的偏相關系數呈負相關；Ca+Mg處理的H+-ATPase活性與草酸、酒石酸、檸檬酸含量的偏相關系數分別呈正、負、負相關，V-PPase酶活性與草酸含量的偏相關系數呈負相關，與酒石酸、蘋果酸等含量的偏相關系數呈正相關。表明不同施肥處理會改變有機酸含量與兩種跨膜運輸酶活性間的線性相關性，說明葉面噴施鈣、鎂營養通過影響跨膜運輸酶活性與有機酸含量的線性相關性而影響有機酸含量。

表1 不同處理和CK四種有機酸含量與兩種酶活性的顯著偏相關系數Table 1 The significant partial correlation coefficients between the contents of four organic acids and two enzymes under different treatments and CK

由表2可見，除Mg處理的草酸含量外，CK和其余處理的草酸含量與兩種酶活性的復相關系數均顯著或極顯著；Mg和Ca處理的蘋果酸含量、CK和Ca+Mg處理的檸檬酸含量分別與兩種酶活性達到顯著或極顯著水平。這說明草酸、蘋果酸、檸檬酸等3種有機酸的積累均受兩種跨膜運輸酶活性變化的影響，任意一種酶活性改變均會引起不同有機酸含量的改變，說明不同處理可能通過影響這些酶活性而影響有機酸的跨膜運輸，進而影響有機酸含量。

表2 不同處理和CK四種有機酸含量分別與兩種酶活性的復相關系數Table 2 The multiple correlation coefficients between the contents of four organic acids with two enzymes respectively under different treatments and CK

2.4.2 水溶性鈣、鎂含量與兩種酶活性 由表3可見，H+-ATPase活性與水溶性鈣、鎂含量的偏相關系數均為負相關，且僅Mg和Ca處理存在相關性；而Ca和Ca+Mg處理的V-PPase活性與水溶性Mg含量分別呈正、負相關，且葉面噴施鈣、鎂肥相對于CK均改變了水溶性鈣、鎂含量與兩種酶活性的線性相關性。可見，水溶性鈣、鎂積累對H+-ATPase、V-PPase活性呈抑制趨勢，且不同的施肥處理可能通過對兩種跨膜運輸酶活性產生不同的調節作用而調節跨膜運輸能力，進而調節有機酸的積累。

表3 不同處理水溶性鈣、鎂與相關酶的顯著偏相關系數Table 3 The significant partial correlation coefficients between the contents of the water-soluble Ca and Mg and related enzymes under different treatments

由表4可見，僅Mg處理的水溶性鈣含量和Ca處理的水溶性鎂含量與兩種跨膜運輸酶的復相關系數具有顯著性，表明葉面噴施鈣、鎂肥分別可能通過影響水溶性鎂、鈣含量而影響兩種酶活性，進而影響有機酸跨膜運輸能力，從而最終影響有機酸的積累。

表4 不同處理和CK水溶性Ca、Mg含量分別與兩種酶活性的復相關系數Table 4 The multiple correlation coefficients between the contents of the water-soluble Ca or Mg with two enzymes respectively under different treatments and CK

3 討 論

荔枝果實蘋果酸在成熟前含量為下降趨勢，酒石酸前期增加成熟后減少，檸檬酸在后期基本檢測不到[19]，本文結果與此結果基本相同，但與棗[20]、李[21]、菠蘿[22]等果實中的各種有機酸含量變化并非一致，這可能與果樹種類不同有關。葉面噴施鈣、鎂肥會影響有機酸含量，其中，Ca和Ca+Mg處理呈促進有機酸積累的趨勢，而Mg處理則可能反之。又由于作為呼吸代謝中間產物的有機酸積累會引起果肉呼吸的負反饋調節[22-23]，于是導致Ca和Ca+Mg處理果肉呼吸代謝在后期較弱，而Mg處理則相反，從而產生課題組前期研究結果，即Ca和Ca+Mg處理后期積累糖分較多，從而緩解果肉“退糖”現象；而Mg處理后期積累糖分較少，從而與CK一樣出現“退糖”現象[25]。

前人報道在甘藍上鈣、鎂營養元素的吸收存在協同關系[26]，筆者前期研究結果也表明水溶性鈣和鎂存在相互增益效應[27]，而在獼猴桃葉片上Ca和Mg卻相互抑制吸收[28]，可見，水溶性鈣、鎂積累問題受遺傳差異影響。本文結果表明，單獨噴施鈣或鎂營養分別會促進果肉中水溶性鈣、鎂積累增多，即水溶性鈣、鎂存在協同作用，與前人研究一致。

有機酸代謝受跨膜運輸酶V-PPase和H+-ATPase的影響，它們都是具有質子泵功能的與液泡膜結合的水解酶[29]，可以催化H+從細胞質轉移到液泡腔，產生酸性內pH值，對果實酸度調節具有重要作用[30]。本文結果表明，葉面噴施Ca、Ca+Mg會抑制兩種跨膜運輸酶活性，并將CK表現出的跨膜運輸酶活性與有機酸含量的負相關改變為正相關，這意味著葉面噴施Ca、Ca+Mg減弱了有機酸跨膜運輸能力[31]，致使糖酵解、三羧酸循環等形成的有機酸積累于細胞質、線粒體，推測葉面噴施Ca、Ca+Mg后果肉有機酸并未象CK那樣轉運進液泡[32]，而是主要積累于液泡外細胞質中和線粒體，從而負反饋調節果肉呼吸作用[23-24]，導致在成熟期減少糖分的呼吸損耗，這進一步解釋了葉面噴Ca、Ca+Mg緩解果肉成熟期“退糖”現象的生理生化原因。

4 結 論

H+-ATPase和V-PPase兩種跨膜運輸酶會影響‘妃子笑’荔枝果肉有機酸主要組分草酸、酒石酸、蘋果酸、檸檬酸等含量；葉面噴施Ca、Mg處理分別通過增加水溶性鎂、鈣含量而減弱H+-ATPase活性，進而減弱細胞質中有機酸跨膜運輸進入液泡的能力，最終可能增加有機酸在液泡外細胞質中的積累。葉面噴Ca、Ca+Mg處理可能通過阻止有機酸跨膜運輸進入液泡而積累于液泡外細胞質中，從而提高果肉總酸含量和調節果肉風味營養品質，并抑制果肉呼吸作用而緩解果肉成熟期“退糖”現象。