重金屬銅、鋅對(duì)火炬樹(shù)幼苗生長(zhǎng)及生理指標(biāo)的影響

杜 雪，彭玉蘭，張新彤，張新銳，李美玄，羅合一，陳國(guó)偉，曲同寶

(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，長(zhǎng)春 130118)

【研究意義】目前，國(guó)家強(qiáng)調(diào)貫徹綠色發(fā)展，促進(jìn)生態(tài)環(huán)境持續(xù)改善，努力建設(shè)人與自然和諧共生的現(xiàn)代化[1]，但隨著經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展，工業(yè)化進(jìn)程的加劇，城鄉(xiāng)建設(shè)排放的廢棄物、生活垃圾，以及農(nóng)業(yè)所用的污水灌溉，農(nóng)藥化肥的不合理施用，使土壤重金屬污染等環(huán)境問(wèn)題日益凸顯[2]。據(jù)調(diào)查顯示，我國(guó)重金屬銅點(diǎn)位和鋅點(diǎn)位超標(biāo)率為2.1%和0.9%[3]，而銅(Cu2+)、鋅(Zn2+)也是植物生長(zhǎng)所必須的微量元素，當(dāng)植物體內(nèi)銅含量達(dá)到30 mg/kg、鋅含量達(dá)到400 mg/kg時(shí)，會(huì)導(dǎo)致大多數(shù)植物中毒[4]，還會(huì)造成土壤污染。因此，修復(fù)和改善土壤污染，成為亟待解決的問(wèn)題?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者針對(duì)土壤重金屬污染修復(fù)技術(shù)領(lǐng)域進(jìn)行了大規(guī)模的探索與研究并取得了一定成果[5]。植物修復(fù)技術(shù)是利用植物自然生長(zhǎng)，通過(guò)吸收等作用機(jī)制來(lái)修復(fù)重金屬污染的土壤，待植株成熟后再進(jìn)行處理的一種原位修復(fù)技術(shù)，因其具有經(jīng)濟(jì)、綠色、環(huán)保及對(duì)土壤擾動(dòng)小等優(yōu)點(diǎn)，更適合生態(tài)的可持續(xù)發(fā)展[6]。篩選出超積累植物對(duì)于植物修復(fù)技術(shù)尤為重要，但目前報(bào)道的超積累植物主要以草本為主，如銅超富集植物鴨跖草、酸模、印度芥菜等[7-9]，鋅超富集植物東南景天、長(zhǎng)柔毛委陵菜、天藍(lán)遏藍(lán)菜等[10-12]；目前篩選的過(guò)程中發(fā)現(xiàn)超富集的喬木和灌木數(shù)量較少，但也有耐性強(qiáng)的喬木，如耐鋅的紫丁香，耐銅的榆樹(shù)、桑樹(shù)、珍珠梅等[13]雖具有耐性但存在植株矮小，生長(zhǎng)緩慢，生長(zhǎng)周期較長(zhǎng)，生物量少以及區(qū)域分布性較強(qiáng)等缺陷，嚴(yán)重限制了修復(fù)效率[14]。進(jìn)一步篩選出生物量大、生長(zhǎng)速度快、適應(yīng)性強(qiáng)、經(jīng)濟(jì)效益高的重金屬超積累植物或耐性強(qiáng)的植物，為重金屬污染土壤修復(fù)提供更多植物選擇。【本研究切入點(diǎn)】火炬樹(shù)(RhustyphinaL．) 是漆樹(shù)科( Anacardiaceae )鹽膚木屬(Rhus) 落葉灌木或亞喬木，因觀賞價(jià)值高被作為園林觀賞樹(shù)種；從1959年被引種后，在應(yīng)用中發(fā)現(xiàn)火炬樹(shù)根系發(fā)達(dá)、分布較淺且萌蘗能力極強(qiáng)，對(duì)環(huán)境適應(yīng)能力強(qiáng)，具有非常強(qiáng)大的生命力，可用于重金屬修復(fù)的選擇性植物[15-16]。之前研究發(fā)現(xiàn)，生長(zhǎng)在鉛鋅尾礦中的火炬樹(shù)生物量大，生長(zhǎng)較高[17]；盆栽實(shí)驗(yàn)中火炬樹(shù)對(duì)鎘、鉛污染有較強(qiáng)的抗性及富集能力[18-20]，但目前缺乏火炬樹(shù)對(duì)重金屬銅、鋅的耐性研究。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】研究不同濃度Cu2+、Zn2+溶液對(duì)火炬樹(shù)種子進(jìn)行單一及復(fù)合脅迫處理，探討火炬樹(shù)受毒害后的生理響應(yīng)、抗逆效果以及各耐性機(jī)制的變化，以期為修復(fù)重金屬銅、鋅污染的土壤提供植物選擇。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

火炬樹(shù)種子采自于吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)校園內(nèi)，千粒重為 9.837 g(去除紅色絨毛狀蠟質(zhì)外種皮后)。

1.2 種子處理

挑選大小均一、顆粒飽滿、健康的種子用90 ℃開(kāi)水進(jìn)行浸種處理，等開(kāi)水冷卻后再浸泡24 h，用蒸餾水沖洗數(shù)次洗去種皮殘?jiān)?，再用無(wú)菌濾紙吸干種子水分，用于發(fā)芽試驗(yàn)[21]。Cu2+、Zn2+的供源分別為CuSO4·7H2O和ZnSO4·7H2O，均為分析純?cè)噭?，設(shè)置以下重金屬濃度。在培養(yǎng)皿中添加Cu2+(0.25、0.50、1.00、1.50、2.00 mmol/L)、Zn2+(0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 mmol/L)，Cu2++Zn2+(0.25 mmol/L+0.50 mmol/L、0.25 mmol/L+2.00 mmol/L、0.25 mmol/L+4.00 mmol/L、1.00 mmol/L+0.50 mmol/L、1.0 mmol/L+2.0 mmol/L、1.0 mmol/L+4.0 mmol/L、2.0 mmol/L+0.5 mmol/L、2.0 mmol/L+2.0 mmol/L、2.0 mmol/L+4.0 mmol/L)各濃度組分別記為T1、T2、T3、T4、T5、T6、T7、T8、T9作為實(shí)驗(yàn)組，以不添加Cu2+、Zn2+作為對(duì)照。

把經(jīng)過(guò)催芽的種子播種于鋪有無(wú)菌濾紙并經(jīng)過(guò)消毒的9 cm培養(yǎng)皿中，每個(gè)培養(yǎng)皿放入30粒種子，重復(fù)3次。依次添加5 mL各重金屬處理液，最后將培養(yǎng)皿置于智能人工氣候培養(yǎng)箱中[參數(shù)設(shè)定：相對(duì)濕度為60%，光照條件：溫度為(25±1)℃，光強(qiáng)為3500 lx，時(shí)間14 h]。黑暗條件：溫度為(20±1)℃，時(shí)間10 h。培養(yǎng)。種子培養(yǎng)期間，每隔2 d，補(bǔ)充2 mL蒸餾水維持一定濕度[19]。每隔24 h觀察并記錄發(fā)芽情況，12 d后進(jìn)行各生理指標(biāo)的測(cè)定。

1.3 生長(zhǎng)指標(biāo)的測(cè)定

以胚芽或胚根的長(zhǎng)度達(dá)突破種皮2 mm時(shí)，每天在固定時(shí)間記錄火炬樹(shù)種子的發(fā)芽數(shù)，待無(wú)繼續(xù)2 d無(wú)種子萌發(fā)時(shí)，發(fā)芽期結(jié)束，共12 d。在已發(fā)芽的各處理中隨機(jī)選取10粒種子，濾紙吸干水分后，用游標(biāo)卡尺測(cè)量其胚根長(zhǎng)、芽長(zhǎng)，稱量鮮重，最后計(jì)算發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)及發(fā)芽指數(shù)參考任艷芳等[22]，計(jì)算公式如下。

發(fā)芽率(GR)= 發(fā)芽種子數(shù)/供試種子數(shù) ×100%

發(fā)芽勢(shì)(GE)= 第3 天內(nèi)發(fā)芽的種子數(shù)/供試種子數(shù)×100%

發(fā)芽指數(shù)(GI)= ∑Gt/Dt

1.4 生理指標(biāo)的測(cè)定

培養(yǎng)周期結(jié)束后，測(cè)定火炬樹(shù)種子幼苗生理生化指標(biāo)。超氧化物歧化酶(SOD)采用氮藍(lán)四唑光還原法測(cè)定，過(guò)氧化物酶(POD)采用愈創(chuàng)木酚顯色法測(cè)定，過(guò)氧化氫酶(CAT)采用紫外吸收法測(cè)定，丙二醛(MDA)采用硫代巴比妥酸法[23]測(cè)定。

1.5 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用Excel 2010進(jìn)行數(shù)據(jù)整理，單因素方差分析和差異顯著性檢驗(yàn)使用軟件SPSS 17.0，Origin V8.0制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 Cu2+、Zn2+單一及復(fù)合脅迫對(duì)火炬樹(shù)種子萌發(fā)及幼苗生物量的影響

如表1～3所示，在不同濃度Cu2+、Zn2+單一及復(fù)合脅迫處理下，火炬樹(shù)種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽指數(shù)、幼苗根長(zhǎng)、芽長(zhǎng)以及鮮重均產(chǎn)生顯著的影響(P<0.05)。單一Cu2+脅迫下，當(dāng)Cu2+濃度為0.25 mmol/L時(shí)顯著促進(jìn)了各指標(biāo)的增長(zhǎng)，隨Cu2+濃度的升高，各指標(biāo)呈下降趨勢(shì)，在2 mmol/L時(shí)達(dá)到最小值，發(fā)芽率降低至對(duì)照的15.75%，發(fā)芽勢(shì)是對(duì)照的23.00%，發(fā)芽指數(shù)是對(duì)照的56.37%，胚根長(zhǎng)及芽長(zhǎng)是對(duì)照的83.96%、43.34%，鮮重是對(duì)照的40.95%，表明Cu2+對(duì)火炬樹(shù)的毒害更強(qiáng)。單一Zn2+脅迫下，當(dāng)濃度為1 mmol/L時(shí)發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)、幼苗根長(zhǎng)、芽長(zhǎng)以及鮮重顯著高于其他處理組并達(dá)到最大值，其幼苗形態(tài)和長(zhǎng)勢(shì)也高于對(duì)照。在復(fù)合脅迫下，各指標(biāo)隨Cu2+、Zn2+含量的上升而降低，且各指標(biāo)均低于單一Cu2+、Zn2+處理組，最低值出現(xiàn)在T9。Cu2+、Zn2+對(duì)火炬樹(shù)種子發(fā)芽及生長(zhǎng)過(guò)程中表現(xiàn)出協(xié)同作用。

表1 Cu2+對(duì)火炬樹(shù)種子萌發(fā)的影響Table 1 Effects of Cu2+ on seed germination of Rhus typhina

表2 Zn2+對(duì)火炬樹(shù)種子萌發(fā)的影響Table 2 Effects of Zn2+ on seed germination of Rhus typhina

表3 Cu2+和Zn2+對(duì)火炬樹(shù)種子萌發(fā)的影響Table 3 Effects of Cu2+ and Zn2+ on seed germination of Rhus typhina

續(xù)表3 Continued table 3

2.2 Cu2+、Zn2+單一及復(fù)合脅迫對(duì)火炬樹(shù)生理指標(biāo)的影響

2.2.1 對(duì)SOD酶活性的影響 從圖1可以看出，與對(duì)照相比，單一脅迫下，火炬樹(shù)幼苗葉片中SOD酶活性隨重金屬濃度的增加，表現(xiàn)出先升高后下降的的趨勢(shì)。單一Cu2+脅迫下，火炬樹(shù)葉片中SOD酶活性，在0.50 mmol/L時(shí)活性最高，比對(duì)照提高了57.54%，在Cu2+濃度為2.00 mmol/L，高濃度脅迫下，SOD酶活性低于對(duì)照。單一Zn2+脅迫下，當(dāng)濃度SOD酶活性顯著降低并且達(dá)到最小值，是對(duì)照的39.25%，酶活性抑制作用強(qiáng)烈。復(fù)合脅迫下，T1處理中火炬樹(shù)葉片中SOD酶活性顯著大于對(duì)照及單一Cu2+脅迫，其余處理隨Cu2+含量的增加而下降，在T9處理時(shí)，SOD酶活性顯著降低并且達(dá)到最小值，是對(duì)照的39.25%，重金屬對(duì)酶活性抑制作用強(qiáng)烈。

(a)單一Cu2+脅迫處理(mmol/L)；(b)單一Zn2+脅迫處理(mmol/L)；(c)Cu2+、Zn2+復(fù)合脅迫處理T1：(0.25+0.50)mmol/L、T2：(0.25+2.00)mmol/L、T3：(0.25+4.00)mmol/L、T4：(1.0+0.5)mmol/L、T5：(1+2)mmol/L、T6：(1+4)mmol/L、T7：(2.0+0.5)mmol/L、T8：(2+2)mmol/L、T9：(2+4)mmol/L。不同小寫字母表示同一指標(biāo)下不同處理間差異顯著(P<0.05)，下同(a)Cu2+ dose in solution(mmol/L);(b)Zn2+ dose in solution(mmol/L);(c)Cu2+ and Zn2+ composite stress treatment T1:(0.25+0.50)mmol/L, T2:(0.25+2.00)mmol/L, T3:(0.25+4.00)mmol/L, T4:(1.0+0.5)mmol/L, T5:(1+2)mmol/L, T6:(1+4)mmol/L, T7:(2.0+0.5)mmol/L, T8:(2+2)mmol/L, T9:(2+4)mmol/L. Different lowercase letters to indicate that there are significant differences between different treatments under the same index at 0.05 level.The same as below圖1 Cu2+、Zn2+單一及復(fù)合脅迫對(duì)火炬樹(shù)SOD酶活性的變化Fig.1 Changes of SOD in Rhus typhina under Cu2+ and Zn2+ single and combined stress

2.2.2 對(duì)POD酶活性的影響 從圖2可以看出，單一及復(fù)合脅迫下，POD酶活性隨濃度的增高呈遞增的趨勢(shì)。在單一Cu2+、Zn2+脅迫濃度最高時(shí)，POD酶活性急劇上升，分別是對(duì)照的4.04、3.81倍，表現(xiàn)出強(qiáng)烈的促進(jìn)作用。在復(fù)合脅迫下，T1～T3處理組，POD活性增長(zhǎng)緩慢，至T7～T9處理組時(shí)POD酶活性迅速提高，并均高于其他復(fù)合及單一Cu2+、Zn2+處理，說(shuō)明高濃度的Cu2+會(huì)促進(jìn)POD酶活性，且促進(jìn)作用高于Zn2+。

圖2 Cu2+、Zn2+單一及復(fù)合脅迫對(duì)火炬樹(shù)POD酶活性的變化Fig.2 Changes of POD in Rhus typhina under Cu2+ and Zn2+ single and combined stress

2.2.3 對(duì)CAT酶活性的影響 從圖3可以看出， Cu2+、Zn2+單一脅迫下，火炬樹(shù)CAT含量隨濃度的升高而增加，在Cu2+濃度1 mmol/L時(shí)，CAT含量高達(dá)15.9 U/g，比對(duì)照升高了29.26%。單一Zn2+脅迫下，與對(duì)照相比，CAT含量在Zn2+濃度1 mmol/L時(shí)達(dá)到最大值，增加了9.19%。在復(fù)合脅迫下，CAT含量均低于對(duì)照，低濃度Zn2+水平上，Cu2+濃度的升高，CAT保持較高水平；在相同Cu2+濃度下，Zn濃度的增高使CAT含量持續(xù)下降，在T9處理時(shí)，達(dá)到最低值，僅3.2 U/g，顯著降低。

圖3 Cu2+、Zn2+單一及復(fù)合脅迫對(duì)火炬樹(shù)CAT酶活性的變化Fig.3 Changes of CAT in Rhus typhina under Cu2+ and Zn2+ single and combined stress

2.2.4 對(duì)丙二醛含量的影響 從圖4可以看出，單一Cu2+、Zn2+及復(fù)合脅迫的處理下，火炬樹(shù)葉片中丙二醛含量均高于對(duì)照組，且隨濃度的增加大致呈上升趨勢(shì)，各處理間差異顯著(P<0.05)。單一Cu2+、Zn2+脅迫下，葉片中丙二醛含量最高值分別出現(xiàn)在Cu2+2 mmol/L和Zn2+4 mmol/L時(shí)，比對(duì)照增加了124.54%、119.54%。Cu2+脅迫下丙二醛含量的上升幅度高于Zn2+脅迫。在復(fù)合脅迫下，火炬樹(shù)葉片中丙二醛含量在相同水平Cu2+處理下，隨Zn2+濃度的增加而上升，在Cu2+濃度為1 mmol/L處理下，Zn2+濃度的升高，上升幅度較同水平Cu2+0.25和2 mmol/L處理組平緩。

圖4 Cu2+、Zn2+單一及復(fù)合脅迫對(duì)火炬樹(shù)丙二醛的變化Fig.4 Changes of MDA in Rhus typhina under Cu2+ and Zn2+ single and combined stress

3 討 論

3.1 Cu2+、Zn2+單一及復(fù)合脅迫對(duì)火炬樹(shù)種子萌發(fā)及幼苗生物量的影響

種子萌發(fā)是植物感知外界環(huán)境的最初生命階段，也是最敏感的階段，容易受到外界環(huán)境變化的干擾[24]。在重金屬Cu2+、Zn2+脅迫火炬樹(shù)種子的條件下，會(huì)對(duì)火炬樹(shù)種子萌發(fā)、生長(zhǎng)及生物量狀況均產(chǎn)生不同程度的影響，其中發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽指數(shù)，胚根長(zhǎng)、芽長(zhǎng)和鮮重均呈低濃度促進(jìn)高濃度抑制的趨勢(shì)，這與Cu2+、Zn2+脅迫地膚種子[25]與包菜種子[26]萌發(fā)試驗(yàn)研究結(jié)果一致。可能是重金屬脅迫會(huì)抑制種子內(nèi)貯藏的淀粉酶和蛋白質(zhì)的分解，同時(shí)降低二者的活性，影響種子在萌發(fā)過(guò)程中所需的物質(zhì)和能量，最終使種子的萌發(fā)受到抑制[27]。復(fù)合脅迫下各生長(zhǎng)指標(biāo)均低于對(duì)照組，在相同Cu2+濃度下加入Zn2+會(huì)在一定程度緩解單一Cu2+脅迫對(duì)各生長(zhǎng)指標(biāo)抑制，并且表現(xiàn)為協(xié)同作用。胚根長(zhǎng)的毒害程度顯著大于芽長(zhǎng)，隨培養(yǎng)時(shí)間和濃度的增加，導(dǎo)致火炬樹(shù)幼苗胚根長(zhǎng)度減短，部分組織易壞死，容易感菌等現(xiàn)象。雖抑制火炬樹(shù)幼苗的生長(zhǎng)，但無(wú)死亡現(xiàn)象，表明火炬樹(shù)種子活力強(qiáng)，具有很強(qiáng)的耐受性。這與蓖麻種子[28]與紅小豆種子[29]研究結(jié)果一致。因?yàn)橹参镌诳怪亟饘俣竞Φ倪^(guò)程中引起酸分泌的減少，激素調(diào)節(jié)紊亂，光合、呼吸代謝功能產(chǎn)生不良影響[30-31]。

3.2 Cu2+、Zn2+單一及復(fù)合脅迫對(duì)火炬樹(shù)生理指標(biāo)的影響

4 結(jié) 論

隨重金屬Cu2+、Zn2+溶液濃度的升高，對(duì)火炬樹(shù)幼苗生長(zhǎng)和生物量的積累均呈現(xiàn)出“低促高抑”的現(xiàn)象。在Cu2+(<0.25 mmol/L)、Zn2+(<1 mmol/L)處理下火炬樹(shù)的發(fā)芽和生物量達(dá)到最大值。

低濃度重金屬脅迫下，SOD、CAT上升緩解了重金屬對(duì)火炬樹(shù)造成的氧化傷害；高濃度脅迫下顯著下降。POD和丙二醛含量在Cu2+(2 mmol/L)、Zn2+(4 mmol/L)以及復(fù)合脅迫(Cu2+2 mmol/L+ Zn2+4 mmol/L)下達(dá)到最大值，使膜脂過(guò)氧化嚴(yán)重，導(dǎo)致植物各細(xì)胞受到嚴(yán)重的傷害。

在單一脅迫下，火炬樹(shù)對(duì)Zn2+的耐受程度大于Cu2+；復(fù)合脅迫下重金屬Cu2+、Zn2+表現(xiàn)為協(xié)同作用，對(duì)火炬樹(shù)的毒害顯著高于單一脅迫，且對(duì)火炬樹(shù)的各指標(biāo)的影響更為復(fù)雜。本試驗(yàn)僅探討了單一Cu2+、Zn2+及復(fù)合脅迫下火炬樹(shù)在種子萌發(fā)期的生長(zhǎng)特性，生理代謝等指標(biāo)的測(cè)定，而重金屬脅迫對(duì)植物生態(tài)及生理機(jī)制等影響是多個(gè)方面的，例如解毒機(jī)制、超微細(xì)胞結(jié)構(gòu)分析、富集轉(zhuǎn)運(yùn)規(guī)律、分子水平的研究等還有待進(jìn)一步研究和探討。