兔BMP4基因對毛囊發育相關基因表達的影響

張 琛，李佳麗，靳榮帥，白少成，姚 凡，趙博昊，陳 陽，吳信生

(揚州大學動物科學與技術學院，江蘇 揚州 225009)

【研究意義】毛囊是哺乳動物特有的皮膚組織，毛囊發育存在周期性并具備自我再生能力。動物的整體毛發發育與毛囊呈正相關[1]。目前，已有不少影響哺乳動物家兔毛囊發育的基因因子被鑒定[2]，如表皮生長因子(Epidermal Growth Factor, EGF)、成纖維生長因子(Fibroblast Growth Factor, FGF)、角蛋白(Keratin)和角蛋白相關蛋白(Keratin Association Protein, KAPs)、類胰島素生長因子(Insulion-Like Growth Factor, IGF)等。骨形態發生蛋白(Bone Morphogenetic Protein，BMP)參與毛囊的生長發育，BMP 信號通路在動物毛發生長過程中發揮重要作用[3]。【前人的研究進展】骨形態發生蛋白4(Bone Morphogenetic Protein 4，BMP4)隸屬于BMPs家族，其作用是抑制毛囊發育，進而調控毛囊形狀、大小和位置[4]。Shh和FGF4促進BMP4的表達，但是BMP4會抑制毛囊發育，進而阻礙FGF4和Shh的表達[5]。毛乳頭細胞(Dermal papilla cells, DPCs)是真皮源性細胞，是毛囊生長、分化的必要信號因子，位于毛囊的基底部[6]，在毛囊周期變化過程中起著重要的作用[7]。【本研究切入點】毛乳頭細胞作為毛囊發育的信號中心，本文通過構建BMP4基因過表達載體，并轉染至家兔毛乳頭細胞中，檢測其對下游相關基因表達的影響，進而驗證BMP4基因對下游基因的調控作用。【擬解決的關鍵問題】為進一步研究BMP4對兔毛乳頭細胞的影響奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 家兔毛乳細胞的分離與鑒定

首先進行毛乳頭細胞的分離，用眼科剪將獺兔兩邊的觸須垂直與皮膚剪下，放入裝有D-Hank’s液的培養皿中進行清洗；70%酒精浸泡1 min，用添加雙抗的PBS沖洗，除去不規則組織。將采集的樣品進行裁剪，裁剪成長條狀組織塊，并放置于無菌細胞培養皿里，緩慢加入0.25%中性蛋白酶，直至浸沒組織塊，4 ℃孵育16～24 h，移除蛋白酶液。在新培養皿中，用精細鑷和眼科剪分離毛囊，轉移到10 mm × 35 mm培養皿中。顯微鏡下用手術刀將毛球部分離，清除周圍其他組織。將分離的單個毛囊放入35 mm培養皿中，加入膠原酶2 mL，37 ℃孵育5～6 h，也可4 ℃過夜消化[8]。

細胞生長至培養瓶70%～80%時，開始轉染實驗，轉染試劑Lipofectamine 3000，具體操作步驟按照試劑盒說明書。設置pcDNA3.1空載組和pcDNA3.1-BMP4過表達組，每個組3個重復。37 ℃培養10 h后進行換液處理，48 h后收細胞。

1.2 儀器與試劑

實驗所用的主要試劑和器材如表1～表2所示。

表2 實驗所用的主要器材Table 2 Main equipment used in the experiment

1.3 兔BMP4基因CDS序列的擴增與克隆

NCBI上查找兔BMP4基因序列(NP_001182652.1)。查找pcDNA3.1載體上的酶切位點。一步克隆軟件(CE Design V1.04)設計BMP4特異性擴增引物。BMP4基因上游引物為：5′-tagtccagtgtggtggaattcATGATTCCTGGTAACCGAATGC-3′；下游為：5′-ggtttaaacgggccctctagaTCAGCGGCACCCAC ACCC-3′。

使用總RNA提取試劑盒提取兔皮膚組織RNA，再通過核酸蛋白分析儀對提取的RNA進行濃度和純度檢測，然后將其反轉錄成cDNA作為下一步高保真酶PCR擴增的模板，進行PCR擴增。反應體系：50 μL，上游引物和下游引物各2 μL、2 × Phanta Max Buffer 25 μL、dNTP Mix 1 μL、Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase 1 μL、模版1 μL、ddH2O 18 μL。擴增程序：95 ℃ 3 min；95 ℃ 15 s，65.5 ℃ 15 s，72 ℃ 2 min，35個循環；72 ℃ 5 min；4 ℃保存。瓊脂糖凝膠電泳檢測反應產物，南京擎科生物科技有限公司測序。

1.4 BMP4生物信息學分析

ProtParam用于預測BMP4編碼蛋白的等電點、分子式、分子量和不穩定性系數(http://web.expasy.org/protparam/)[9]。信號肽預測用SignalP 4.1(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-4.1/)[10]。分析分泌蛋白、定位信號和蛋白跨膜區域用TMHMM 2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)[11]。潛在的絲氨酸、蘇氨酸或酪氨酸磷酸化位點預測用NetPhos 3.1 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)[12]。蛋白質二級結構預測用Hopfield(http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_gor4.html)[13]。推測蛋白質結構保守域和三維同源性用SWISS-MODEL[14]。

1.5 BMP4過表達載體的構建與鑒定

將BMP4擴增產物和pcDNA3.1質粒用EcoI和XbaI快切酶進行雙酶切，用T4DNA連接酶連接。然后轉化至大腸桿菌DH5α細胞中并均勻涂抹至含有氨芐青霉素的LB瓊脂板上，在37 ℃條件下，培養12 h。然后進行選擇單菌落PCR，陽性克隆液送擎科生物科技有限公司測序，用SeqBuilder軟件進行序列分析。使用測序正確的克隆菌液提取質粒備用。

1.6 CCK-8檢測細胞增殖

兔毛乳頭細胞在24孔板內培養48 h后，將細胞分別接種于4個96孔板內以檢測0、24、48、72 h時的細胞增殖狀況。待細胞貼壁后，吸出培養基。在每孔內分別加入10 μL CCK-8溶劑，放入細胞培養箱孵育4 h，放入酶標儀檢測吸光度OD450值，記為0 h。以后每24 h用同樣的方法測量1次，共4次。

1.7 熒光定量PCR

提取兔毛乳頭細胞中的RNA。細胞在24孔板底部長至95%，收集細胞，按照RNA提取試劑盒說明書提取RNA。將提取的RNA進行濃度和純度測定，并反轉錄成cDNA。使用軟件Primer Premier 5.0設計BMP4、ID1、ID2、SMAD7、FGF1、TGF-β基因引物。具體引物信息如表2所示(其中GAPDH為內參基因)。

表2 引物信息Table 2 Primer information

1.8 數據分析

SPSS 22.0分析數據，方法為成對T檢驗，采用2-△△Ct法進行分析，每組3個重復。*P<0.01為差異極顯著，**P<0.05為差異顯著。

2 結果與分析

2.1 兔毛乳頭細胞的鑒定

兔毛乳頭細胞分離培養后，用標志性基因α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)和波形蛋白(VIM)進行免疫熒光檢測。特異性標記物α-SMA及毛囊真皮源性細胞標記物VIM均呈現綠色熒光，為陽性表達，DAPI核染定位顯示，細胞核中有藍色熒光(圖1)。

圖1 兔毛乳頭細胞的免疫熒光染色鑒定Fig.1 Identification of rabbit hair papilla cells by immunofluorescence staining

2.2 BMP4基因的克隆

對兔BMP4基因片段進行擴增，獲得與預期片段大小一致的明亮條帶，長度為1230 bp(圖2-A)。菌液PCR的電泳分析(圖2-B)顯示，在目的基因處可見明亮條帶。

M.DL 5000 DNA 分子標記。A.BMP4基因擴增結果；1，2，3為目的基因BMP4基因條帶。B.BMP4基因菌液PCR結果；1，2，3，4，5，6為目的基因BMP4基因條帶M.DL 5000 DNA marker.A.BMP4 gene amplification results；1, 2 and 3 were both BMP4 gene bands of the target gene.B.PCR results of BMP4 gene bacterial；1,2,3,4,5,6 were the bands of the target gene BMP4圖2 BMP4基因克隆Fig.2 Cloning of BMP4 genesolution

2.3 BMP4基因生物信息學分析

兔BMP4基因CDS區序列全長1230 bp，編碼409個氨基酸，2個外顯子，BLAST分析表明該序列與NCBI發布的序列(NP_001182652.1)完全一致，并位于第17號染色體上。BMP4蛋白的分子量為46 511.76，分子式為C2043H3205N623O592S17，pI理論值為8.73，帶正電荷的殘基總數為51，帶負電荷的殘基總數為46，表明該蛋白整體上帶正電荷。親水性的總體平均值為-0.571，預計不穩定性指數(II)為59.56，表明該蛋白為不穩定蛋白。脂肪族指數為77.46。具有穩定的信號肽(圖3-A)，切割位點最高為0.554，位于第25個氨基酸殘基，而位于第16個氨基酸殘基處信號肽區域的最高值為0.953；信號肽得分(第1至24個氨基酸殘基)為0.872。不包含跨膜結構域，細胞質中N末端的總概率為0.10364(圖3-B)。

BMP4蛋白的11個絲氨酸、3個蘇氨酸和3個酪氨酸具有假定的磷酸化位點。在編碼的409個氨基酸中，有128個氨基酸(31.30%)形成了α-螺旋，76個氨基酸(18.58%)形成了一條延伸鏈，而205個氨基酸(50.12%)形成一個無規則卷曲(圖3-C)。預測的蛋白三級結構如3-D所示。

2.4 BMP4基因過表達對毛囊發育相關基因的影響

實時熒光定量PCR結果顯示，過表達BMP4基因后其mRNA水平顯著提高(P<0.01，圖4-A)。

A.過表達后的BMP4 mRNA表達水平;B.下游基因表達水平A.mRNA expression level after overexpression;B.Downstream gene expression level圖4 BMP4過表達對相關基因的影響Fig.4 Effects of BMP4 overexpression on related genes

BMP4基因過表達后，其下游基因ID1、SMAD7和ID2的表達量與對照組相比顯著升高(P<0.01)，FGF1的表達量顯著降低(P<0.05，圖4-B)。

2.5 過表達BMP4會抑制細胞增值

CCK-8實驗顯示，隨著時間的延長，相比對照組pcDNA3.1，過表達BMP4組細胞增值能力逐漸減弱，在72 h時差異極顯著(P<0.01，圖5)。

圖5 過表達BMP4基因對細胞增殖的影響Fig.5 Effect of overexpression of BMP4 gene on cell proliferation

3 討 論

毛囊是哺乳動物具有周期性再生功能的皮膚附屬器官，毛囊的結構和性狀會影響毛用動物的被毛質量以及品質。毛乳頭細胞是毛囊中重要的真皮成分，產生多種針對上皮細胞的調節因子，可誘導上皮細胞增殖分化，進而形成毛囊[15]。在裸鼠中，將毛乳頭細胞與表皮細胞一起移植會誘導毛囊產生。當毛乳頭細胞與毛囊上皮一起培養時，會促進毛囊上皮的生長[16]。

毛乳頭細胞與毛囊其他真皮細胞不同，毛乳頭細胞能表達特定的基因及蛋白[17]。α平滑肌肌動蛋白(α-SMA)，一種已知的毛乳頭細胞標記物[18]。波形蛋白(VIM)是毛囊真皮源性細胞標記物，用來鑒別真皮源性細胞與表皮源性細胞[19]。有研究采用中性蛋白酶與膠原酶兩步消化法及預鋪設鼠尾膠原促貼壁基質相結合，檢測到α-SMA和VIM的表達，成功分離并純化家兔毛乳頭細胞[20]。有研究采用一步酶消化法對胎兒頭皮毛乳頭細胞進行分離，并使用雌二醇處理原代毛乳頭細胞，發現雌二醇顯著調節人毛乳頭細胞生物鐘基因的表達水平[21]。本實驗免疫熒光結果顯示分離出的細胞表達α-SMA和VIM，表明分離的細胞為毛乳頭細胞。

BMP信號通路在皮膚的發育過程中起關鍵作用[22-23]。BMP信號可以通過抑制皮膚形態發生過程中毛囊分化促進表皮發育[24-25]。研究發現，在皮膚受損愈合過程中，BMP4的表達受到抑制[26]。通過對鵝BMP4基因的部分進行擴增，并與其他動物進行比較，發現BMP4基因可能是影響毛發形態的因素之一[27]。BMP4不僅會影響動物的毛發形態，并且在毛囊和羽毛發生發育過程中有表達且主要起負調控作用[28]。BMP4基因在絨山羊毛囊發育過程中，退行期時表達量最高，并且隨著毛囊周期發育逐漸降低[29]。本研究通過對敲除和過表達BMP4基因細胞增殖情況進行鑒定，發現過表達BMP4基因會抑制毛乳頭細胞的生長。研究表明，FGF-1通過誘導毛囊生長期毛囊數量和大小增長，促進毛囊生長[30]。本研究中，BMP4過表達對FGF-1有抑制作用，與BMP4在其他物種上的已知功能一致。Id基因家族中，ID1、ID2和ID3是典型BMP信號通路中磷酸SMADS的直接靶標，對BMP刺激高度敏感[31-32]。研究發現，通過在毛乳頭細胞中過表達BMP4導致ID1、ID2、SAMD7的mRNA表達水平顯著升高，與已有研究結果一致。

4 結 論

BMP4共編碼409個氨基酸，為親水性外分泌蛋白，含有1個信號肽序列，無跨膜結構域。過表達BMP4可調控兔毛乳頭細胞中ID1、ID2、SMAD7的mRNA表達，抑制毛乳頭細胞增殖，參與家兔毛囊的生長發育。