枯草芽孢桿菌KC-WQ 發酵液中抗菌脂肽的分離鑒定及發酵條件優化

錢 榮，續曉琪，許宗奇，徐 虹，李 莎，徐 錚，羅正山

（南京工業大學食品與輕工學院，江蘇南京 211816）

沙門氏菌、大腸桿菌以及金黃色葡萄球菌作為常見的食源性致病菌，危害著公共食品安全[1]，尋找安全有效的抗菌物質刻不容緩。脂肽作為一種來源于微生物的表面活性劑，具有抗菌、抗病毒等多種功效[2]。與傳統抗生素不同，抗菌脂肽具有易降解、熱穩定性高、不易形成耐藥性、綠色安全等優勢[3]。高曉平等[4]研究表明，表面活性素具有抑制乳中大腸埃希菌O157 的功效，延長乳的保質期。具有環狀結構的抗菌脂肽防腐劑可以抑制其本身對蛋白酶的敏感性，同時抑制病原菌如黃曲霉等生長繁殖[5]，有效控制食品中有害微生物的滋生，具有一定食品防腐保鮮功能[6]。

自然界中酵母菌、真菌、細菌等多種微生物都可以產生脂肽，目前已發現的主要有隱桿菌屬、類芽孢桿菌屬、梭菌屬、游動放線菌屬、芽孢桿菌屬、假單胞菌屬、沙雷氏菌屬、鐮孢霉屬、鏈霉菌屬、節桿菌屬、分支桿菌屬、短桿菌屬和解硫胺素芽孢桿菌屬[7?13]等，包含陸地和海洋微生物。枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）能產生多種抗菌脂肽[14]，主要包括伊枯草菌素（Iturin）、芬薺素（Fengycin）和表面活性素（Surfactin）三大家族；其中Iturin 和Fengycin 相比于其他抗菌脂肽，有較強的抗菌活性；而Surfactin 在抑制病毒、支原體等方面有較好的效果[15?18]。這些抗菌脂肽大多可以通過發酵條件優化實現增產[19]。目前，喻鋼等[20]建立了基于制備型反相色譜柱分離純化枯草芽孢桿菌細菌素類抗菌活性物質方法。抗菌脂肽的分離純化主要通過電荷差異、疏水性質以及分子量不同實現雜質去除，從而達到純化的目的[21]。

抗菌脂肽作為一種天然的抗菌成分，目前仍面臨產率低、成本高等問題[22]，在食品、醫療的應用缺少進一步的研究。本實驗自主篩選得到一株枯草芽孢桿菌KC-WQ 作為出發菌株，考察其胞外發酵產物的抑菌特性，分離其中的抗菌脂肽并解析其結構，通過耐高溫測試評價其用于食品加工[23]的潛力。最后優化發酵條件，建立響應面預測模型，旨在提高產量，并為生產流程、實際應用提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

枯草芽孢桿菌KC-WQ 從發酵豆粕中分離得到，經16S 鑒定后保藏于中國典型培養物保藏中心（武漢大學保藏中心，保藏號CCTCC NO：M 2021799）；BL21 大腸桿菌（Escherichia coliBL21）、鼠傷寒沙門氏菌TA97a（SalmonellaTA97a）和嗜水氣單胞菌ATCC35654（Aeromonas hydrophilaATCC35654）均由南京工業大學微生物實驗室提供；三氯甲烷 上海凌峰化學試劑有限公司；甲醇 上海邁瑞爾化學技術有限公司；鹽酸 永華化學科技有限公司；Surfactin標準品 上海麥克林生化科技有限公司；LB 液體培養基、PDA 培養基 青島海博生物技術有限公司。

D-78532 隔水式培養箱 上海一恒科學儀器有限公司；UNIVERSAL320（R）離心機 德祥科技有限公司；BKQ-B100II 高壓蒸汽滅菌鍋 賽鍶鈦氪貿易有限公司；ZQZY-88CN 振蕩培養箱 上海知楚儀器有限公司；DH100-2 干式恒溫器 杭州瑞誠儀器有限公司；S210 pH計梅特勒-托利多儀器有限公司；RE-52AA 旋轉蒸發器 上海亞榮生化儀器廠；752S 紫外可見分光光度計 上海棱光技術有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌株活化和培養 將枯草芽孢桿菌KC-WQ接種于LB 液體培養基37 ℃、200 r/min 條件下培養24 h 作為種子液，將種子液以3%濃度接種在Landy改良培養基[19]內，37 ℃、200 r/min 條件下發酵48 h。Landy 改進培養基：葡萄糖20.0 g，谷氨酸鈉5.0 g，酵母提取物1.0 g，MgSO40.5 g，KCl 0.5 g，KH2PO41.0 g，FeSO40.15 mg，MnSO40.5 mg，CuSO40.16 mg，蒸餾水定容至1.0 L。

1.2.2 牛津杯抑菌圈實驗 取出提前制備的平板，劃分區域，將50 μL 活化接種量為1.5%的沙門氏菌作為指示菌液滴加于PDA 平板上，用一次性涂布棒涂布均勻。取出滅菌后的牛津杯放置在平板四個區域，設置只添加100 μL LB 培養基作為空白對照，其余三個牛津杯中分別滴加除去菌體的KC-WQ 發酵液，加樣體積依次為50、100、150 μL。隨后平板置于37 ℃培養箱內培養12 h 后，觀察并測量抑菌圈大小，重復三次，取平均值。

1.2.3 抗菌脂肽的制備 在滅完菌的Landy 培養基里按照3%接種量接種，200 r/min，37 ℃發酵48 h，發酵液8000 r/min，4 ℃離心10 min，取上層清夜備用。用6 mol/L HCl 調節上層清液pH 至4.0，4 ℃、12 h過夜沉淀，8000 r/min，4 ℃離心10 min。離心棄去上層清液，收集沉淀，將得到的沉淀加入過量甲醇溶解。將溶解后的液體過有機膜抽濾除去雜質，45 ℃旋轉蒸發濃縮，得到甲醇粗提液。將粗提液用65 ℃烘箱烘干，收集黃色沉淀，即為抗菌脂肽粗提物[22]。

1.2.4 粗提物成分和結構分析

1.2.4.1 TLC 薄層色譜分析 稱取脂肽粗提物50 mg，溶于1500 μL 甲醇作為待測樣品溶液。取一塊硅膠薄層板，在距離一邊1 cm 處用鉛筆畫線，作為樣品起始點，設置A、B 兩組平行實驗。按照薄層色譜法，使用毛細管蘸取溶液，分別點于兩點上，每次10 μL，點樣5 次，每次點完用吹風機吹干，備用。配置展開劑為甲醇:三氯甲烷:水=25:65:4。將展開劑、薄層板放入展缸中展開、揮干，觀察在紫外燈下的條帶。

1.2.4.2 高效液相色譜分析 本部分采用安捷倫1260 高效液相色譜儀和ZORBAX Eclipse XDBC18 色譜柱（5 μm，150 mm×4.6 mm）進行分析，樣品與標準品均溶于20%乙腈水溶液，流動相A 為乙腈（含0.1% 三氟乙酸），流動相B 為超純水（含0.1%三氟乙酸），流動相比例A:B 為8:2，流速為1 mL/min，檢測波長為214 nm，樣品濃度為5 mg/mL，進樣體積為60 μL。

1.2.4.3 MALDI-TOF-MS 質譜分析 質譜檢測條件：粗提物10 mg 溶于10 mL 甲醇溶劑，正離子檢測，DHB 基質。使用UltrafleXtreme MALDI-TOF質譜儀（Bruker Daltonics）在反射正離子模式下進行MALDI 儀器質譜分析。用智能束激光輻照產生的離子在100～1700 Da 的質量范圍內獲得了質譜，照射頻率為1000 Hz，PIE 為120 ns，透鏡電壓為7 kV。第一離子源電壓為20 kV，第二離子源電壓為17.65 kV。每個光譜由平均1000 次激光發射產生，并且激光輻照度被設置為50%～55%。使用FlexAnalysis 軟件（version：3.3，Bruker）處理質譜圖。

1.2.5 耐熱性測定 將用上述方法提取的抗菌脂肽配制成1.0 mg/mL 的溶液，在45、65、85、105 ℃條件下加熱20 min，以未經處理的原樣品作為對照組，以沙門氏菌為指示菌評價其抑菌效果，測量抑菌圈直徑，重復三次，取平均值。

1.2.6 最小抑菌濃度測定 將由方法1.2.3 提取的抗菌脂肽樣品做濃度遞減稀釋，分別為25、12.2、6.2、3.1、1.6、0.8、0.4 mg/mL，對沙門氏菌做抑菌試驗，以抑菌圈大于10 mm 為依據確定最小抑菌濃度[21]，重復三次，取平均值。

1.2.7 發酵條件優化

1.2.7.1 碳源優化 根據初始發酵培養基，以添加2%碳源進行優化實驗，分別選取單一碳源葡萄糖、麥芽糖、蔗糖和混合碳源（葡萄糖1%+淀粉1%）進行單因素實驗，保持其余發酵條件一致。使用紫外可見分光光度計測在600 nm 處測定OD 并按照方法1.2.3 所述測定抗菌脂肽粗提物產量，以OD600和抗菌脂肽粗提物產量作為實驗評價指標，重復三次，取平均值。

1.2.7.2 氮源優化 在初始發酵培養基的基礎上加入0.25%的不同氮源進行單因素實驗設計。選取尿素，胰蛋白胨作為氮源，另外設計無氮源對照組同步進行，實驗保持其余發酵條件一致。評價方法同上，重復三次，取平均值。

1.2.7.3 搖床轉速優化 選擇發酵溫度為37 ℃，pH 為7，裝液量為200 mL，發酵時間為48 h，選擇轉速分別為150、180、200、250 r/min，其余條件保持一致。評價方法同上，重復三次，取平均值。

1.2.7.4 發酵溫度優化 選擇發酵pH 為7，裝液量為200 mL，發酵時間為48 h，轉速為200 r/min，溫度分別為30、33、35、37 ℃，其余條件保持一致。評價方法同上，重復三次，取平均值。

1.2.7.5 發酵初始pH 優化 選擇發酵溫度為37 ℃，裝液量為200 mL，發酵時間為48 h，轉速為200 r/min，初始pH 為5.0、6.0、7.0、8.0，其余條件保持一致。評價方法同上，重復三次，取平均值。

1.2.7.6 響應面試驗 在單因素實驗培養基優化的基礎之上，以抗菌脂肽粗產量Y 作為響應值，對初始pH（X1）、發酵溫度（X2）、搖床轉速（X3）構建三因素三水平的響應面優化分析（表1）。

表1 各變量及其高低水平設計Table 1 Variables and their high and low level design

1.3 數據處理

數據分統計學析實驗重復3 次，數據結果用“平均值±標準差”表示，IBM SPSS Statistics 19.0 軟件進行分析，方差分析（ANOVA）判斷多重平均值的顯著性，顯著性水平P<0.05 表示具有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 抑菌活性驗證

如圖1 所示，枯草芽孢桿菌KC-WQ 發酵液對三種致病菌增殖具有明顯的抑菌效果。對比抑菌圈平均值直徑的大小發現（表2），發酵液抑菌效果與劑量呈正相關，相同劑量下的發酵液對沙門氏菌的抑制效果最為顯著，抑菌圈直徑最高達到了（16.50±2.18）mm；對大腸桿菌和嗜水氣單胞菌也有較好的抑制效果，最大抑菌圈直徑分別為（12.83±2.37）mm 和（15.77±1.57）mm。相比白杰等[21]報道的枯草B3菌株，KC-WQ 發酵液抑菌效果更為明顯，因此為進一步驗證抑菌效果，采用沙門氏菌作為指示菌進行后續評價實驗。

圖1 枯草芽孢桿菌KC-WQ 胞外發酵液抑菌圖Fig.1 Antibacterial diagram of extracellular fermentation broth of Bacillus subtilis KC-WQ

表2 枯草芽孢桿菌KC-WQ 抑菌圈直徑Table 2 Inhibition zone diameter of Bacillus subtilis KC-WQ

2.2 脂肽粗提物產量及結構分析

將上述枯草菌株發酵培養，酸沉淀法制得抗菌脂肽，產量為（0.763±0.03）g/L。TCL 法對脂肽粗提物進行初步分析，紫外燈下顯色后在a、b 之間有多段活性成分的顯色印跡（圖2），表明其組分較為復雜。

2.3 HPLC 結果分析

對比KC-WQ 的抗菌脂肽樣品和Surfactin 標準品的液相圖譜出峰時間（圖3）發現，該菌株粗提物的保留時間在9～20 min 之間。抗菌脂肽樣品在9～11 min，13～16 min 和19～21 min 的保留時間與標準品一致，可以證實該抗菌脂肽中含有Surfactin 的同系物。

圖3 脂肽粗提物與標準品HPLC 保留時間對比Fig.3 Comparison of HPLC retention time between crude lipopeptide extract and standard product

表3 結果顯示，KC-WQ 菌株的脂肽粗提物在HPLC 中的保留時間范圍為9.977～20.897 min。與Surfactin 標準品對比，抗菌脂肽樣品中同樣保留時間的峰面積占據整個出峰面積的46.315%，表明該抗菌脂肽中有近50%的Surfactin 成分，其余脂肽尚無商品化純品做對照，進一步采用MALDI-TOF-MS鑒定分析。

表3 脂肽粗提物樣品HPLC 保留時間及面積Table 3 HPLC retention time and area of crude lipopeptide extract sample

2.4 MALDI-TOF-MS 分析結果

進一步采用質譜分析抗菌脂肽組成，根據黃君[24]的文獻報道，采用m/z 對脂肽進行分類。m/z 在1030.4～1059.4 的范圍屬于Iturin 族，在994.4～1036.4屬于Surfactin 族（圖4a），在1449.4～1491.4 為Fengycin 族（圖4b）。由于抗菌脂肽主要由1 個疏水脂肪烴鏈與7～10 個氨基酸構成的環肽相連，其結構差異主要表現在脂肪烴鏈的碳原子個數[25]，而脂肪烴鏈的長短不同，導致了每增加或減少一個碳原子，m/z 相差14。本實驗得到的抗菌脂肽的主要成分為C13～C16 Iturin、Iturin 族中的C13～C15 Bacillomycin D、C12～C15 Surfactin 以及少量的C15～C18 Fengycin A（表4）。結果證明這些粗提物的主要成分是三種抗菌脂肽的混合物，有良好的抑菌表現，同時該類抗菌脂肽已被證明具有生物安全性[26]，可開發應用于食品加工環節中對有害微生物的控制、防腐保鮮等方面[27]。

表4 MS 結果分析Table 4 MS result analysis

圖4 脂肽粗提物MALDI-TOF 結果Fig.4 MALDI-TOF analysis results of crude lipopeptide extract

2.5 抗菌脂肽理化性質分析

2.5.1 溫度對抗菌脂肽的影響 牛津杯法抑菌實驗的結果發現（圖5），枯草KC-WQ 的脂肽粗提物經45、65、85、105 ℃處理20 min 后，抑菌效果并未出現明顯變化。抑菌圈直徑隨著溫度的上升略有數值降低但不顯著（P<0.05），說明該脂肽粗提物中的抑菌成分可耐高溫。這些短鏈多肽具有熱穩定性，可進行噴干等涉及高溫處理的工藝[28]，具有較好的加工特性。

圖5 抗菌脂肽耐熱效果評價Fig.5 Evaluation of the heat resistance of lipopeptides

2.5.2 最小抑菌濃度測定 由表5 可知，該抗菌脂肽在較低濃度時仍對沙門氏菌有抑菌效果，最小抑菌質量濃度為0.8 mg/mL。

表5 不同濃度的KC-WQ 抗菌脂肽對沙門氏菌的抑菌效果Table 5 Inhibition of different concentrations of KC-WQ crude lipopeptide against Salmonella

2.6 發酵條件優化結果

2.6.1 碳源優化結果 實驗得到的脂肽粗產物及OD 值如圖6（a）所示。在對碳源的優化中，發現葡萄糖和淀粉以1:1，共20 g/L 的濃度時抗菌脂肽粗產量實現最大，同時在600 nm 波長處的吸光值也是同組實驗最大值。在發酵過程中，碳源的選擇直接影響到細菌的繁殖及代謝速率，在一定范圍內，發酵液菌群濃度與其在600 nm 波長處的吸光值成正比[29]，且在吸光度最大時，抗菌脂肽產量最高。根據以上結果，可以選取葡萄糖+淀粉作為最佳碳源。

圖6 碳源（a）、氮源（b）優化對脂肽粗產量及OD600nm 的影響Fig.6 The influence of carbon source （a） and nitrogen source （b） optimization on the crude lipopeptide yield and OD600nm

2.6.2 氮源優化結果 實驗得到的粗產物質量及OD值如圖6（b）所示。從結果中可以看出，添加胰蛋白胨時該菌的粗產物產量最高，并且發酵菌液在600 nm的吸光度為最高，由于氮源包含大量菌體在生長代謝過程中所需物質，不僅影響菌體繁殖生長，也會影響后期的抗菌脂肽的產量。胰蛋白胨含有豐富的氮源和氨基酸，促進菌體的生長代謝，因此可以作為KCWQ 枯草芽孢桿菌最佳氮源。

2.6.3 搖床發酵條件優化結果 搖床轉速是決定發酵過程中通氣量的關鍵因素，通氣量對菌體的氧化分解作用有著顯著的影響。優化結果如圖7a 所示。在轉速達到200 r/min 時，得到的粗產物產量及OD 值均為最大。當轉速變高或者降低時，都會導致反應產物及OD 值減少，枯草芽孢桿菌屬于好氧菌，適當提高轉速有利于其增殖和脂肽積累，因此選用200 r/min 的轉速作為適宜搖床轉速。

初始pH 對菌體生長有顯著的影響，pH 過高或過低都會影響發酵速度和發酵產量。優化結果如圖7b 所示。當pH 為5 時，脂肽粗產量最低；之后隨pH 的升高，產量上升；當環境呈現略堿性時（pH8），產量反而下降，但仍高于pH5 時的產量。因此綜合考慮適宜發酵初始pH 為7.0 進行后續試驗。

溫度是影響菌體發酵的重要因素，溫度過高會加快菌體的代謝反應速率，縮短生長周期，菌體提前衰老影響發酵。溫度太低則會導致氧化還原速率降低，菌體生長周期變長，抗菌脂肽產量下降。優化結果如圖7c 所示。隨著溫度的升高，粗產物產量和OD值穩步提高，到達35 ℃時達到頂峰，隨后下降。因此可以選取35 ℃作為發酵的適宜溫度。

圖7 搖床發酵條件優化結果Fig.7 Optimized results of shaker fermentation conditions

2.7 響應面試驗

利用Design-Expert 軟件建立回歸方程進行結果分析，以抗菌脂肽粗產量Y 值作為響應值，得出多元擬合二項式模型，并對模型的顯著性進行評估，最終預測出最佳發酵條件，根據預測值進行實驗驗證，判斷模型的契合度。

利用Design-Expert 軟件對表6 的數據進行分析設計，得出脂肽粗產量（Y）對初始pH（X1）、發酵溫度（X2）和搖床轉速（X3）的二次多項回歸模型方程為：

表6 響應值試驗及結果Table 6 Response value test and results

從表7 得知，模型的F值為15.15，P值為0.0008，達到了顯著水平，失擬項為0.0954>0.05，不顯著。發酵條件X1的P<0.001，說明初始pH 對發酵影響非常顯著；X2的P<0.01，說明發酵溫度對發酵高度顯著；X3表現出不顯著。模型的決定系數R2=0.9512>0.9，說明模型的線性關系顯著，校正決定系數R2Adj=0.8884，說明模型與實驗數據契合度較高，因此可以用模型預測發酵條件對枯草芽孢桿菌抗菌脂肽產量的影響。

表7 二次多項回歸模型方差結果Table 7 Quadratic polynomial regression model variance results

2.7.1 構建響應面分析結果 根據回歸模型并利用Design-Expert 軟件繪制出響應面優化結果，得到了發酵溫度、搖床轉速、初始pH 三個因素之間的3D 模型圖，圖8a 反應了搖床轉速與初始pH 對脂肽粗產量的交互關系，圖8b 反應了發酵溫度與初始pH 對脂肽粗產量的交互關系，圖8c 反應了搖床轉速與發酵溫度對脂肽粗產量的交互關系。經過軟件進一步的結果分析，得出響應面分析結果優化后的預測發酵條件：初始pH=6.0，發酵溫度為36 ℃，搖床轉速為208 r/min，預測產物產量為1.311 g/L。

圖8 脂肽粗產量的響應面曲線圖及等高線圖Fig.8 Response surface curve and contour plot of crude lipopeptide yield

2.7.2 回歸模型的驗證 為了檢驗模型的準確性，對模型預測的數值進行檢測實驗。為便于實驗的操作性，所有預測值取整數，因此取發酵溫度為36 ℃，初始pH=6.0，搖床轉速為208 r/min。設置三個平行組，選用優化培養基進行發酵實驗，最后得到抗菌脂肽粗產量為1.236 g/L，達到了預測值的94.28%，數值較為接近預測值，說明模型預測可靠性高，可以較好地反映發酵條件各個因素對產物的影響。

3 結論

枯草芽孢桿菌是一種天然的益生菌，分泌純天然的抗菌脂肽，在食品、醫療等領域有著較好的開發前景。本實驗以篩選到的枯草KC-WQ 為研究對象，其胞外產物具有抑菌特性，對腸道類致病菌有著較好的抑菌效果；酸沉淀法獲得抗菌脂肽，結合TLC、MALDI-TOF-MSL 和HPLC，鑒定其主要成分為Iturin、Bacillomycin D、Surfactin 和Fengycin A。該抑菌脂肽具有較好的耐熱性，對沙門氏菌的最小抑菌濃度為0.8 mg/mL。最后，針對該菌株進行發酵條件優化，設計響應面和回歸方程，得到最適發酵條件：初始pH6.0，發酵溫度為36 ℃，搖床轉速為208 r/min，預測產量為1.311 g/L，經實驗驗證，最后實際得到的抗菌脂肽產量為1.236 g/L。本研究獲得的枯草芽孢桿菌KC-WQ，其胞外所產抗菌脂肽對Salmonellaentericasubsp.enterica、Aeromonas hydrophila和Escherichia coli等常見食源性污染菌具有顯著抑菌效果，理化性質穩定，在食品加工行業具備應用潛質。