HPLC 法分別測定大苞荊芥中2 種黃酮及其糖苷的含量

帕爾哈提·多力坤，買買提江·阿布都瓦克，朱金芳, ，劉 燁，買爾當·艾尼瓦爾

（1.新疆農業大學食品科學與藥學學院，新疆烏魯木齊 830052；2.新疆維吾爾醫學專科學校藥學系，新疆和田 848000）

大苞荊芥為唇形科（Labiatae）荊芥屬大苞荊芥（Nepeta bracteataBenth）的干燥全草，維吾爾名為“祖發印地”，收載于《阿力卡農》《依合提亞拉提拜地依》《買克散艾地維》等古籍中，其生干生熱、溫肺平喘、祛寒止咳、燥濕祛痰、發汗解毒、消炎退腫[1?2]。《維吾爾藥志》中記載大苞荊芥全草具有止咳平喘、清熱利濕的作用，用于治療氣管炎、咳嗽氣喘、感冒發燒等癥[3]。由于荊芥屬植物營養豐富、氣味獨特，常被用作食品調味劑和保鮮劑使用[4?5]。但目前尚無專門針對大苞荊芥的質量研究報道，大多數文章都是將大苞荊芥作為神香草或硬尖神香草的混淆品進行性狀鑒別[6]、薄層色譜鑒別[7]、HPLC 法測定齊墩果酸與熊果酸含量及指紋圖譜的對比研究[8]。因此，建立大苞荊芥的含量測定方法，進而制定其質量標準，對于大苞荊芥原料質量的控制及其在保健食品中的應用具有重要的現實意義。

雖然大苞荊芥在民間使用較為廣泛，但國內外有關大苞荊芥的研究報道較少，張萌等[9]報道大苞荊芥總多糖對哮喘大鼠有明顯的干預效果，其作用主要表現在大苞荊芥總多糖對Th1/Th2 細胞相關細胞因子（IFN-γ和IL-4）失衡等免疫學改變的逆轉作用以及對IL-6 和IL-17 等炎癥細胞因子表達的抑制；阿不都熱依木·玉蘇甫等[2]研究發現，大苞荊芥總黃酮具有抗菌消炎、止咳、祛痰、平喘作用。由文獻可知，大苞荊芥的活性成分應該為多糖和黃酮類成分，但大苞荊芥總多糖與大多數植物多糖一樣，主要通過調節機體免疫系統而發揮作用，其特征性不強。而黃酮類化合物大多數具有顯著的消炎、抗過敏、抗菌、抗病毒、止咳、祛痰、抗自由基氧化等作用，并廣泛應用于食品藥品中[10?11]，與大苞荊芥的功能作用吻合。故本實驗選擇黃酮類成分作為大苞荊芥含量測定的指標成分。ABDUWAKI 等[12]從大苞荊芥總黃酮中分離得到木犀草素、芹菜素、芹菜素-7-O-葡萄糖醛酸苷（Apigenin-7-O-glucuronide,AGCRP）、木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷（Luteolin-7-O-β-Dglucuronide,LGCRP）、木犀草素-7-0-β-半乳糖苷、香葉木素-7-0-β-D-葡萄糖苷等多種黃酮及黃酮苷類成分。本課題組通過前期預實驗發現大苞荊芥中木犀草素、芹菜素、LGCRP、AGCRP 含量相對較高且分離度較好，故選擇定量測定以上黃酮及其糖苷類成分。另外，由于大苞荊芥中木犀草素、芹菜素與其糖苷的性質、含量相差較為懸殊，且出峰時間間隔較遠，若在一個條件下同時測定四個成分，則會導致有效成分提取不充分、單次測定耗時較長、峰形及分離度不好等問題，故采用兩套方法分別測定木犀草素、芹菜素及LGCRP、AGCRP 的含量。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

15 批大苞荊芥藥材生產批號分別為S1（20151029）、S2（20170830）、S3（20171030）、S4（20181211）、S5（20190117）、S6（20190207）、S7（20190523）、S8（20191119）、S9（20191209）、S10（20200507）、S11（20200526）、S12（20200530）、S13（20200601）、S14（20200715）、S15（20200826）S3～S9 購自新疆新綠寶藥業有限公司，其他均購自新疆麥迪森維藥有限公司。15 批藥材經新疆維吾爾自治區藥品檢驗研究院艾買提江·阿依甫別克副主任藥師鑒定為唇形科荊芥屬大苞荊芥的干燥全草。木犀草素 中國食品藥品鑒定研究院，批號：111520-200504，純度≥98%；芹菜素 上海源葉生物科技有限公司，批號：TO4S8F43072，純度≥98%；LGCRP中國食品藥品鑒定研究院，批號：111968-201602，純度97.7%；AGCRP 廣州雋沐生物科技股份有限公司，批號：DM21032005，純度99.48%；乙腈 色譜純，Sigma 公司；所有試劑如未特殊標明均為分析純；水為純凈水。

AL204-IC 型電子天平 梅特勒-托利多儀器上海有限公司；KQ5200 型超聲波清洗儀 昆山市超聲儀器有限公司；TG16B 型高速離心機 鹽城市凱特實驗儀器有限公司；LC-16 高效液相色譜儀 蘇州市島津儀器有限公司。

1.2 木犀草素、芹菜素含量測定方法學研究

1.2.1 對照品溶液的制備 精密稱取木犀草素11.1 mg、芹菜素10.9 mg，分別置于10 mL 量瓶中，加甲醇定容至刻度，分別配成濃度為1.11、1.09 mg/mL的對照品儲備液。

1.2.2 供試品溶液的制備 稱取大苞荊芥藥材（粉粹，過20 目篩，制成粗粉）約2.00 g，置于50 mL 具塞錐形瓶中，加70%乙醇，搖勻，稱定重量，固定超聲波功率為300 W，超聲提取30 min，用70%乙醇補足減失重量，搖勻，過濾，離心10 min（14000 r/min），上清液作為供試品溶液待測。

1.2.3 色譜條件 色譜柱：InertSustion C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相A：乙腈溶液，流動相B：0.1%磷酸水溶液（0.1:99.9，v/v）[13?14]；流速：1.0 mL/min；檢測波長：347 nm；柱溫30 ℃；進樣量20 μL，按表1 洗脫程序進行洗脫[15?16]。

表1 洗脫程序Table 1 Elution program

1.2.4 樣品前處理方法的考察

1.2.4.1 提取溶劑的考察 稱取同一批大苞荊芥藥材粉末，分為6 組，每組3 份，每份約2.00 g，按“1.2.2”項下方法制備供試品溶液，每組分別加入甲醇、70%甲醇、50%甲醇、無水乙醇、70%乙醇、50%乙醇溶劑[17?19]，使用液相色譜儀測定，并按公式（1）計算木犀草素、芹菜素含量。

式中：C 表示供試品濃度，μg/mL，由峰面積代入標準曲線計算得出；D 表示溶液稀釋體積，mL；m 表示藥材取樣量，g。

1.2.4.2 溶劑加入量的考察 稱取同一批大苞荊芥藥材粉末，分為5 組，每組3 份，每份約2.00 g，按“1.2.2”項下方法制備供試品溶液，每組分別加入70%乙醇20、30、40、50、60 mL，使用液相色譜儀測定[20]，并按公式（1）計算木犀草素、芹菜素含量。

1.2.4.3 提取時間的考察 稱取同一批大苞荊芥藥材粉末，分為5 組，每組3 份，每份約2.00 g，按“1.2.2”項下方法制備供試品溶液，每組分別超聲提取10、20、30、40、50 min，使用液相色譜儀測定[21?23]，并按公式（1）計算木犀草素、芹菜素含量。

1.2.5 方法學考察

1.2.5.1 系統適用性試驗 在上述色譜條件下，取各對照品、供試品及溶劑空白溶劑依次進樣，檢測HPLC 條件是否符合要求。

1.2.5.2 線性關系、檢出限及定量限 分別精密吸取對照品儲備液用70%乙醇制成含木犀草素3.080～12.321 μg/mL，芹菜素4.753～19.010 μg/mL 的混合對照品溶液，以對照品濃度X（μg/mL）為橫坐標，峰面積Y 為縱坐標，分別計算對照品木犀草素、芹菜素的線性回歸方程和線性范圍，按信噪比（S/N）約為3 計算檢出限（LOD），以S/N 約為10 計算定量限（LOQ）。

1.2.5.3 精密度試驗 吸取同一對照品連續進樣5 次，在“1.2.3”色譜條件下測定峰面積并計算RSD 值。

1.2.5.4 穩定性試驗 稱取同一批大苞荊芥藥材粉末參照“1.2.2”的方法進行制備，于0、2、4、6、8、12、18、24 h 進樣并測定峰面積，計算RSD 值。

1.2.5.5 重復性試驗 稱取同一批大苞荊芥藥材粉末6 份照參“1.2.2”的方法進行制備，于“1.2.3”色譜條件進樣檢測，確定峰面積并計算含量與RSD 值。

1.2.5.6 加標回收率試驗 精密稱取已知含量樣品約1.00 g，按低、中、高濃度分別加入木犀草素、芹菜素對照品儲備液，置于50 mL 具塞錐形瓶中，加70%乙醇，搖勻，稱定重量，固定超聲波功率為300 W，超聲提取30 min，用70%乙醇補足減失重量，搖勻，過濾，離心10 min（14000 r/min），進樣測定，按供試品處理方法得溶液，記錄峰面積，并按公式（2）計算加標回收率。

1.2.5.7 大苞荊芥藥材中木犀草素、芹菜素含量測定稱取15 批大苞荊芥藥材粉末制成供試品溶液，并按“1.2.3”色譜條件進樣檢測，并按公式（1）計算各批次大苞荊芥中木犀草素、芹菜素的含量。

1.3 LGCRP、AGCRP 含量測定方法學研究

1.3.1 對照品溶液的制備 精密稱取LGCRP 11.5 mg、AGCRP 11.6 mg，分別置于10 mL 量瓶中，加甲醇定容至刻度，分別配成濃度為1.15、1.16 mg/mL的對照品儲備液。

1.3.2 供試品溶液的制備 稱取同一批大苞荊芥藥材粉末0.25 g，置于50 mL 具塞錐形瓶中，加50%甲醇，搖勻，稱定重量，固定超聲波功率為300 W，超聲提取20 min，用50%甲醇補足減失重量，搖勻，過濾，離心10 min（14000 r/min）上清液作為供試品溶液待測。

1.3.3 色譜條件 按照“1.2.3”項的方法，按表2 洗脫程序進行洗脫[24?27]。

表2 洗脫程序Table 2 Elution program

1.3.4 樣品前處理方法的考察

1.3.4.1 提取溶劑的考察 稱取同一批大苞荊芥藥材粉末，分為6 組，每組3 份，每份約0.25 g，同“1.2.4.1”的方法制備供試品溶液，并按1.2.4.1 方法，注入液相色譜儀測定，并按公式（1）計算LGCRP、AGCRP 含量。

1.3.4.2 溶劑加入量的考察 稱取同一批大苞荊芥藥材粉末，分為5 組，每組3 份，每份約0.25 g，同“1.2.4.2”的方法制備并注入液相色譜儀測定，并按公式（1）計算LGCRP、AGCRP 含量。

1.3.4.3 提取時間的考察 稱取同一批大苞荊芥藥材粉末，分為5 組，每組3 份，每份約0.25 g，同“1.2.4.3”的方法制備并注入液相色譜儀測定，并按公式（1）計算LGCRP、AGCRP 含量。

1.3.5 方法學考察

1.3.5.1 系統適用性試驗 在上述色譜條件下，取各對照品、供試品及溶劑空白溶劑依次進樣，檢測HPLC 條件是否符合要求。

1.3.5.2 線性關系、檢出限及定量限 分別精密吸取對照品儲備液用50%甲醇制成含LGCRP 5.67～22.68 μg/mL，AGCRP 9.97～39.86 μg/mL 的混合對照品溶液二，以對照品濃度X（μg/mL）為橫坐標，峰面積Y 為縱坐標，分計算到對照品LGCRP、AGCRP的線性回歸方程和線性范圍，按信噪比（S/N）約為3 計算檢測限（LOD），以S/N 約為10 計算定量限（LOQ）。

1.3.5.3 精密度試驗、穩定性試驗、重復性試驗 方法同“1.2.5”。

1.3.5.4 加標回收率試驗 分別精密稱取已知含量樣品約0.125 g，按低、中、高濃度分別加入LGCRP、AGCRP 對照品儲備液，置于50 mL 具塞錐形瓶中，加50%甲醇，搖勻，稱定重量，固定超聲波功率為300 W，超聲提取20 min，用50%甲醇補足減失重量，搖勻，過濾，離心10 min（14000 r/min），進樣測定，按供試品處理方法得溶液，記錄峰面積，并按公式（2）計算加樣回收率。

1.3.5.5 大苞荊芥藥材中LGCRP、AGCRP 含量測定 稱取15 批大苞荊芥藥材粉末制成供試品溶液，采用“1.3.3”色譜條件進樣檢測，并按公式（1）計算各批次大苞荊芥中LGCRP、AGCRP 的含量。

1.4 數據處理

通過與SHIMADZU LC-16 儀器配套的LabSolutions 色譜處理軟件完成數據采集分析，采用Excel、Origin 2018 軟件進行圖形繪制及處理，每組重復3 次，結果用±SD 表示。

2 結果與分析

2.1 木犀草素、芹菜素含量測定結果

2.1.1 樣品前處理方法的考察 考慮木犀草素、芹菜素具有易溶于甲醇及乙醇的水溶液的特點[28]。本實驗對6 種提取溶劑進行考察。結果顯示，隨著甲醇或乙醇在水中比例的增加，木犀草素、芹菜素的含量呈上升趨勢，用70%乙醇提取時木犀草素、芹菜素含量均最高，但用純甲醇及無水乙醇提取時木犀草素、芹菜素含量均最低，因木犀草素、芹菜素屬于極性化合物，根據中藥化學成分與溶劑間“極性相似相容”的原理，選擇對有效成分溶解度大的溶劑作為提取溶劑[29]，因此，選擇70%乙醇作為提取溶劑，結果見圖1a。

圖1 不同提取條件對大苞荊芥中木犀草素、芹菜素含量的影響（n=3）Fig.1 Effects of different extraction conditions on the content of luteolin and apigenin in Nepeta bracteata (n=3)

圖1b 中可以看出，隨著溶劑加入量的增加，木犀草素、芹菜素的含量呈上升趨勢，當加入量為50 mL時，木犀草素、芹菜素的含量均達到最高，但再增加到60 mL 時，其含量略有下降，因為溶劑的溶解性能、溶解能力，通過溶劑的溶解度來確定，合適的溶劑用量能提高有效成分的溶解度，而溶解度達到全溶解狀態后，再增加溶劑用量時會降解有效成成分的含量。說明加入50 mL 溶劑就能充分提取藥材中2 種黃酮，故確定溶劑加入量為50 mL。

由于超聲提取比常規提取效率高并節省時間，通常藥材進行超聲處理20～45 min 即可獲得較好的提取效果，圖1c 顯示，提取時間從10 min 增加到20 min 時，木犀草素、芹菜素含量未發生明顯變化，到30 min 時其含量有所提高，而提取時間增加到40 min 之后其含量開始下降，這是因為超聲提取可使生物分子解聚，使細胞壁上的有效成分更快地溶解于溶劑中，一般提取時間在20～40 min 即可獲得最佳提取效率，而提取時間過長影響提取效率會降低有效成分的含量，故選擇超聲提取時間為30 min。

2.1.2 方法學考察

2.1.2.1 系統適應性試驗 確定色譜條件時參考了多篇測定木犀草素、芹菜素含量的文獻[30?34]。最終確定色譜條件為乙腈溶液：0.1%磷酸水溶液為流動相，流速1.0 mL/min，檢測波長347 nm。此條件下色譜峰出峰時間快且對稱性好，分離度>1.5，理論塔板數>5000，空白溶劑無干擾，符合實驗要求。結果見圖2。

圖2 木犀草素和芹菜素系統適用性試驗HPLC 圖譜Fig.2 System suitability test HPLC pattern of luteolin and apigenin

2.1.2.2 線性關系、檢出限及定量限 結果表明，木犀草素和芹菜素濃度分別在3.080～12.321、4.753～19.010 μg/mL 范圍內與峰面積具有良好的線性關系，相關系數達到0.9993 以上。木犀草素和芹菜素的LOD 分別為0.11 和0.08 μg/mL，木犀草素和芹菜素的LOQ 分別為0.35 和0.23 μg/mL。結果見表3。

表3 木犀草素和芹菜素的回歸方程、相關系數、線性范圍、檢出限及定量限Table 3 Regression equation,correlation coefficient,linear range,limit of detection and limit of quantification of luteolin and apigenin

2.1.2.3 精密度試驗 取混合對照品溶液按色譜條件連續進樣6 次，記錄峰面積。求得木犀草素、芹菜素峰面積的RSD 值分別為0.62%、0.73%，表明儀器的精密度良好。

2.1.2.4 穩定性試驗 取同一供試品溶液，分別于0、2、4、6、8、12、18、24 h 按色譜條件進樣檢測峰面積。求得木犀草素、芹菜素含量的RSD 值分別為0.90%、1.33%，表明制備的供試品溶液在24 h 之內較為穩定。

2.1.2.5 重復性試驗 取同一大苞荊芥藥材，平行制備6 份供試品溶液，進樣測定峰面積。求得木犀草素、芹菜素平均含量分別為109.825、170.621 μg/g，RSD值分別為1.39%、1.39%，說明該方法重復性良好。

2.1.2.6 加標回收率試驗 木犀草素、芹菜素加標回收率范圍分別為98.8%～102.8%、92.9%～98.1%，RSD值范圍分別為0.97%～2.25%、0.24%～2.94%，表明方法準確度高，結果見表4。

表4 加標回收率試驗結果（n=3）Table 4 Standard recovery test results (n=3)

2.2 LGCRP、AGCRP 含量測定結果

2.2.1 樣品前處理方法的考察 本實驗對6 種提取溶劑進行考察。結果顯示，使用50%甲醇或70%乙醇提取時，LGCRP、AGCRP 的含量均較高，且用50%甲醇提取LGCRP、AGCRP 含量均最高，但用純甲醇及無水乙醇提取時LGCRP、AGCRP 含量均最低，因此，選擇50%甲醇作為提取溶劑，結果見圖3a。

圖3 不同提取條件對大苞荊芥中LGCRP、AGCRP 含量的影響（n=3）Fig.3 Effects of different extraction conditions on the content of LGCRP and AGCRP in Nepeta bracteata (n=3)

圖3b 中可以看出，隨著溶劑加入量的增加，LGCRP、AGCRP 的含量呈上升趨勢，當加入量為50 mL 時，LGCRP、AGCRP 的含量均達到最高，但再增加到60 mL 時，其含量明顯下降，說明加入50 mL溶劑能充分提取藥材中2 種黃酮苷，故確定溶劑加入量為50 mL。

圖3c 顯示，與提取10 min 相比，提取時間為20 min 時LGCRP、AGCRP 含量均明顯提高，而提取時間增加到30 min 之后其含量明顯下降，故選擇超聲提取時間為20 min。

2.2.2 方法學考察

2.2.2.1 系統適用性試驗 最終確定色譜條件為乙腈溶液：0.1%磷酸水溶液為流動相，流速1.0 mL/min，檢測波長347 nm。此條件下色譜峰出峰時間快且對稱性好，分離度>1.5，理論塔板數>5000，空白溶劑無干擾，符合實驗要求。結果見圖4。

圖4 LGCRP、AGCRP 系統適用性試驗HPLC 圖譜Fig.4 System suitability test HPLC pattern of LGCRP and AGCRP

2.2.2.2 線性關系、檢出限及定量限 結果表明，LGCRP 和AGCRP 濃度分別在5.67～22.68、9.97～39.86 μg/mL 范圍內與峰面積具有良好的線性關系，相關系數達到0.9997 以上。LGCRP 和AGCRP 的LOD 均為0.03 μg/mL，LGCRP 和AGCRP 的LOQ分別為0.09 和0.10 μg/mL。結果見表5。

表5 LGCRP、AGCRP 的回歸方程、相關系數、線性范圍、檢出限及定量限Table 5 Regression equation,correlation coefficient,linear range,limit of detection and limit of quantification of LGCRP,AGCRP

2.2.2.3 精密度試驗取 混合對照品溶液按色譜條件連續進樣6 次，記錄峰面積。求得LGCRP、AGCRP峰面積的RSD 值分別為0.67%、0.83%，表明該方法精密度良好。

2.2.2.4 穩定性試驗 取同一供試品溶液，分別于0、2、4、6、8、12、18、24 h 按色譜條件進樣檢測峰面積。求得LGCRP、AGCRP 含量的RSD 值分別為1.23%、1.07%，表明制備的供試品溶液在24 h 之內較為穩定。

2.2.2.5 重復性試驗 取同一大苞荊芥藥材，平行制備6 份供試品溶液，進樣測定峰面積。求得LGCRP、AGCRP 含量分別為2.147、4.194 mg/g 的RSD 值分別為1.10%、0.79%，說明該方法重復性良好。

2.2.2.6 加標回收率試驗 LGCRP、AGCRP 加標回收率范圍分別為93.9%～97.9%、93.7%～97.3%，RSD值范圍分別為1.01%～1.65%、1.12%～1.74%，表明方法準確度高，結果見表6。

表6 加標回收率試驗結果（n=3）Table 6 Standard recovery test results (n=3)

2.2.3 樣品含量測定 檢測15 批大苞荊芥中的木犀草素、芹菜素、LGCRP、AGCRP 含量，結果見表7，15 批樣品木犀草素含量為63.501～126.337 μg/g，芹菜素含量為44.964～321.198 μg/g，LGCRP 含量為1.556～3.051 mg/g，AGCRP 含量為2.533～7.154 mg/g。建議大苞荊芥藥材中木犀草素、芹菜素、LGCRP、AGCRP 的含量限度分別不得少于60.00 μg/g、40.00 μg/g、1.50 mg/g、2.50 mg/g。

表7 樣品含量測定結果（n=3，±SD）Table 7 Sample content determination results (n=3,±SD)

表7 樣品含量測定結果（n=3，±SD）Table 7 Sample content determination results (n=3,±SD)

不同生產批號大苞荊芥中芹菜素含量差異較大，最高含量與最低含量相差近7 倍。且大苞荊芥中芹菜素含量隨儲藏時間的延長存在降低的趨勢，與文獻報道一致。丁春光等[35]認為不同儲藏年限廣陳皮黃酮類化合物含量隨儲藏時間延長而降低。含量降低的原因比較復雜，既可能與藥材儲藏過程中相關酶的活性變化有關[36]，也可能與藥材揮發性成分的散失有關[37]。

3 結論

本實驗優化了提取溶劑、溶劑加入量、提取時間等藥材前處理方法，并通過系統適用性試驗，線性關系、檢出限及定量限考察，精密度、重復性、穩定性及加標回收率試驗進行了含量測定方法學驗證，建立了HPLC 法分別定量測定大苞荊芥中木犀草素、芹菜素及其糖苷木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷（LGCRP）、芹菜素-7-O-葡萄糖醛酸苷（AGCRP）的方法。結果顯示木犀草素、芹菜素和LGCRP、AGCRP分別在3.080～12.321、4.753～19.010、5.67～22.68、9.97～39.86 μg/mL 范圍內與各自峰面積呈良好的線性關系，r值均大于0.9993；檢出限分別為0.11、0.08、0.03、0.03 μg/mL，定量限分別為0.35、0.23、0.09、0.10 μg/mL，精密度、穩定性和重復性均良好，加標回收率范圍分別為98.8%～102.8%、92.9%～98.1%、93.9%～97.9%、93.7%～97.3%。表明兩套方法操作簡便、靈敏度高、穩定性好、準確度高、適用性強，可用于大苞荊芥中2 個黃酮及其糖苷類成分的定量測定，為大苞荊芥藥材質量的控制及其在成方制劑中的應用奠定了基礎。