金屬有機骨架衍生氧化物材料作為MALDITOF MS 基質用于氨基酸分析

朱禹豪，楊亞非，曹東麗 ，夏 炎

（1.南開大學化學學院，南開大學中心實驗室，天津 300071；2.天津市食品安全檢測技術研究院，天津 300308）

氨基酸是蛋白質的基本組成單位，在大部分生命活動中發揮著重要作用[1]。機體中氨基酸的濃度變化與多種疾病有關，且能反映機體代謝情況。傳統氨基酸分析方法大多存在預處理步驟復雜、分析成本高昂、分析時間長、樣品需求量大等問題，因此，探究準確快速的分析氨基酸類物質的有效方法在疾病診斷和生命科學分析領域具有重要作用[2]?；|輔助激光解吸電離飛行時間質譜（matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS）是一種簡單、高效的新型軟電離質譜技術，以實驗周期短、預處理步驟簡單、樣品消耗低、靈敏度高等優點，在蛋白質、肽鏈的分析中被廣泛應用[3]，在氨基酸分析領域的拓展中有良好潛力。但在MALDI 的激光照射下，適用于大分子代謝物的傳統基質本身也會發生電離破碎，在小分子范圍內（<500 Da）產生嚴重信號干擾[4]。因此，用MALDITOF MS 直接進行小分子代謝物（100～500 Da）的檢測是一項相對困難的工作。

近年來，研究者們拓展了諸如碳基材料[5]、納米材料[6]、金屬/金屬氧化物材料[7?9]、金屬有機骨架（metal-organic frameworks，MOFs）[10?12]、共價有機骨架（covalent-organic frameworks，COFs）[13]和MOF@COF[14]等材料作為MALDI-TOF MS 的新型基質材料用于檢測小分子代謝物，其中，MOFs 和納米金屬氧化物材料由于其獨特的性質受到了廣泛關注。MOFs 的高孔隙率和大比表面積使得其作為基質易于與樣品形成均勻分散的共結晶體系，材料在紫外范圍的強激光吸收能力也符合MALDI 部分對激光能量吸收轉移的要求；另外，由于MOFs 本身的多孔性、大比表面積、多活性位點、空間結構、易于修飾、組成元素多樣性等特征，以MOFs 為模板/前驅體進行碳基材料[15]、金屬氧化物材料[16?18]及其他衍生材料[17,19?22]的合成和應用也被廣泛報道。金屬/金屬氧化物納米材料具有與紫外光產生相互作用的能力，這使得金屬/金屬氧化物納米材料具有作為MALDITOF MS 基質的應用潛力；最重要的是，該類材料作為基質可以很好地避免低質量區（100～500 Da）的自身干擾，在MALDI-TOF MS 小分子檢測中有良好的應用前景[7,23?25]。其中，TiO2納米粒子（nanoparticles，NPs）在紫外區表現出很強的吸收特性，相關文獻也報道了通過TiO2NPs 復合各種基質[8?9,26?27]，例如：α-氰基-4-羥基肉桂酸（α-cyano-4-hydroxy-cinnamic acid，CHCA）、2,5-二羥基苯甲酸（2,5-dihydroxybenzoic acid，DHB）及一些有較好應用的MOFs 等，制備出新型復合基質材料，在低質量區既能避免信號干擾，又能促進激光解吸電離過程，在MALDI-TOF MS 中取得了更好的應用檢測效果。

本研究利用TiO2NPs 的優良特性，參考Dekrafft等[17]報道的一種簡單、廉價、可調、可擴展的金屬有機框架（MOFs）模板策略，經傳統MOFs 修飾后再合成具有獨特物理化學性質的混合金屬氧化物納米復合材料，作為MALDI 基質和吸附劑，用于高效分析氨基酸生物小分子。該金屬氧化物納米復合材料具有規則晶型的納米級多孔結構，有助于其作為MALDI 基質與目標物形成均勻的共結晶體系，從而解決金屬氧化物基質檢測重現性差的問題，同時可顯著提高氨基酸小分子目標物的電離效率和檢測結果的信噪比，實現氨基酸類小分子代謝物的同時精確檢測，擁有在MALDI-TOF MS 的小分子代謝物分析領域巨大的應用潛力。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

脯氨酸（proline，Pro） 上海J&K 化工有限公司；異亮氨酸（isoleucine，Ile）、組氨酸（histidine，His）、色氨酸（tryptophan，Try）、對苯二甲酸（pphthalic acid，H2BDC）和硝酸鉻（Chromium Nitrate，Cr（NO3）3） 天津光復精細化工研究所；氯化鋯（Zirconium（IV）chloride，ZrCl4） 美國馬薩諸塞斯特林試劑公司；中-四（4-羧基苯基）卟吩（meso-Tetra（4-carboxyphenyl）porphine，TCPP）、苯甲酸天津希恩思試劑公司；二（2-羥基丙酸）二氫氧化二銨合鈦（Titanium（IV）bis（ammonium lactato）dihydroxide solution，TALH） 美國圣路易斯奧德里奇試劑公司；乙醇、乙腈（acetonitrile，ACN）、N,N-二甲基甲酰胺（N,N-dimethylformamide，DMF） 康科德試劑公司；氫氟酸（Hydrogen fluoride，HF） 天津市北聯精細化工有限公司；納米二氧化鈦（Titanium Dioxide nanoparticles，TiO2NPs） 自制；去離子水（18.2 MΩ cm）天津理化分析中心；實驗中所有試劑均為分析純。

SmartLab X 射線衍射儀（采用λ=1.5418 ? Cu Kα射線，測試范圍3～60°） 日本理學；Apreo S LoVac場發射掃描電子顯微鏡 FEI 捷克有限公司；Autoflex III TOF/TOF200 型基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜儀（采用波長為337 nm 的smartbeam 激光器）德國布魯克；KH-400KDH 超聲波清洗器 中國昆山禾創超聲儀器有限公司；SX2-4-12 馬弗爐 慧通五金（廣州）電熱設備有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 金屬有機骨架衍生氧化物材料制備

1.2.1.1 MIL-101（Cr）的制備 通過已報道的方法[10]來制備MIL-101（Cr），將80.0 mg 硝酸鉻和332.0 mg對苯二甲酸溶于10.0 mL 去離子水中，滴加0.1 mL氫氟酸攪拌均勻，室溫下用70 Hz 的超聲波超聲分散15 min 后，將所得溶液轉移到聚四氟乙烯內襯的20 mL 不銹鋼高壓反應釜中，220 ℃下加熱8 h。在8000 r/min 的轉速下，離心15 min 并收集所得綠色固體，分別用DMF 和乙醇洗滌三次，離心，最后在60 ℃真空干燥過夜。取出稱量得71.5 mg 綠色固體粉末產物。

1.2.1.2 UiO-66（Zr）的制備 通過已報道的方法[11]來制備UiO-66（Zr），將159.0 mg 氯化鋯和102.0 mg對苯二甲酸溶于20.0 mL 的DMF 中攪拌均勻，室溫下用70 Hz 的超聲波超聲分散15 min 后，將所得溶液轉移到聚四氟乙烯內襯的50 mL 不銹鋼高壓反應釜中，120 ℃下加熱24 h。在8000 r/min 的轉速下，離心15 min 并收集所得白色固體，分別用DMF 和乙醇洗滌三次，離心，最后在60 ℃真空干燥過夜。取出稱量得112.0 mg 白色固體粉末產物。

1.2.1.3 PCN-222（Zr）的合成 通過已報道的方法[28?29]來制備PCN-222（Zr），將18.8 mg 氯化鋯、18.0 mg TCPP 和800.0 mg 苯甲酸溶于5.0 mL 的DMF 中攪拌均勻，室溫下用70 Hz 的超聲波超聲分散15 min后，將所得溶液轉移到聚四氟乙烯內襯的20 mL不銹鋼高壓反應釜中，120 ℃下加熱48 h。在8000 r/min 的轉速下，離心15 min 并收集所得紫色固體，分別用DMF 和乙醇洗滌三次，離心，最后在60 ℃真空干燥過夜。取出稱量得20.0 mg 紫色固體粉末產物。

1.2.1.4 Cr2O3@TiO2的合成 參考文獻[17]報道的方法模板化制備Cr2O3@TiO2。將合成好的MIL-101（Cr）粉末稱取40.0 mg 溶于20.0 mL 0.1 mol/L HCl 溶液中，滴加1.3 mL TALH，充分攪拌后，室溫下用70 Hz 的超聲波超聲分散30 min 使粉末在溶液中分散均勻。將溶液在室溫條件下500 r/min 轉速磁力攪拌2 h，得到泛白的綠色溶液。溶液在8000 r/min 的轉速下，離心20 min 并收集所得綠色固體沉淀，將沉淀轉移到坩堝中，放入馬弗爐空氣氛圍下550 ℃煅燒16 h。取出稱量得深綠色固體粉末11.0 mg。

1.2.1.5 （UiO-66）-ZrO2@TiO2的制備 參考文獻[17]報道的方法模板化制備（UiO-66）-ZrO2@TiO2。將合成好的UiO-66（Zr）粉末稱取70.0 mg 溶于35.0 mL 0.1 mol/L HCl 中，滴加1.2 mL TALH，充分攪拌后，室溫下用70 Hz 的超聲波超聲分散30 min 使粉末在溶液中分散均勻。將溶液在室溫條件下500 r/min轉速磁力攪拌2 h，得到乳白色溶液。溶液在8000 r/min 的轉速下，離心20 min 并收集所得白色固體沉淀，將沉淀轉移到坩堝中，放入馬弗爐空氣氛圍下550 ℃煅燒16 h。取出稱量得灰白色固體粉末16.0 mg。

1.2.1.6 （PCN-222）-ZrO2@TiO2的制備 參考已報道的方法[17]模板化制備（PCN-222）-ZrO2@TiO2。將合成好的PCN-222（Zr）粉末稱取20.0 mg 溶于15.0 mL 0.1 mol/L HCl 中，滴加1.0 mL TALH，充分攪拌后，室溫下用70 Hz 的超聲波超聲分散30 min使粉末在溶液中分散均勻。將溶液在室溫條件下500 r/min 轉速磁力攪拌2 h，得到粉紫色溶液。溶液在8000 r/min 的轉速下，離心20 min 并收集所得紫色固體沉淀，將沉淀轉移到坩堝中，放入馬弗爐空氣氛圍下800 ℃煅燒4 h。取出稱量得白色固體粉末10.4 mg。

1.2.2 基質結構表征

1.2.2.1 SEM 表征 使用FEI 捷克有限公司Apreo S LoVac 場發射掃描電子顯微鏡，分辨率：0.7 nm@15 kV，1.0 nm@1 kV（高真空）；1.0 nm@15 kV，1.8 nm@3 kV（低真空）；0.8 nm@30 kV（stem）；加速電壓：200 V～30 kV；電子槍：超穩定肖特基電子槍。

1.2.2.2 XRD 表征 使用日本理學SmartLab X 射線衍射儀，管壓40 kV，管流150 mA，掃描速度15°/min，Cu Kα輻射，在3～60°角范圍內獲得了X 射線衍射（XRD）圖。

1.2.3 MALDI-TOF MS 分析

1.2.3.1 用于MALDI-TOF MS 分析樣品的準備將Pro、Ile、His、Try 溶解在去離子水中，濃度為0.1 mg·mL?1；Ile 和His 溶解在去離子水中，濃度為0.01、0.001 mg·mL?1。所得溶液在4 ℃的冰箱中存儲，供進一步使用。

1.2.3.2 用于MALDI-TOF MS 分析的基質準備和點靶方法 將MIL-101（Cr）、UiO-66（Zr）、PCN-222（Zr）、Cr2O3@TiO2、（UiO-66）-ZrO2@TiO2、（PCN-222）-ZrO2@TiO2分散在乙腈中，濃度為0.1、0.01、0.001 mg·mL?1。將TiO2NPs 分散在乙腈中，濃度為0.1 mg·mL?1。

采用傳統的干滴分析方法，使用MIL-101（Cr）、UiO-66（Zr）、PCN-222（Zr）、Cr2O3@TiO2、（UiO-66） -ZrO2@TiO2、（PCN-222） -ZrO2@TiO2、TiO2NPs 為基質時，將2 μL 待測物分析液與2 μL 基質混合，然后將2 μL 的混合物轉移至金屬靶上，待其自然晾干后進行測試。

1.2.3.3 MALDI-TOF MS 測試條件設置 MALDITOF MS 檢測氨基酸使用的儀器為Bruker AutoflexⅢ質譜儀（德國），該儀器使用337 nm smartbeam 激光。在所有的實驗中，使用正離子反射模式，80%激光強度進行檢測。每個記錄的質譜都是由200 個單獨的200 Hz 激光發射的平均數據產生的。

1.3 數據處理

在目標物檢測過程中，在同一個靶點中隨機選取4 個點進行平行實驗測試，所得數據使用Flex Analysis 和Origin 軟件處理。

2 結果與分析

2.1 MOF-衍生金屬氧化物的表征

在探究MOF-衍生金屬氧化物作為基質輔助電離/解吸前，用XRD 和SEM（圖1）對制備的MOF-衍生金屬氧化物進行表征。由圖可知，Cr2O3@TiO2的特征峰在24.5°、34°、36°、41.5°、50.5°、55°分別與Cr2O3（012）、Cr2O3（104）、Cr2O3（110）、Cr2O3（113）、Cr2O3（024）和Cr2O3（116）的平面相關[30]，在25°與TiO2（101）的平面相關[31]。（PCN-222）-ZrO2@TiO2與（UiO-66）-ZrO2@TiO2在25°、30°的特征峰分別與TiO2（101）[32]、ZrO2（101）[33]的平面相關。合成的三種MOF-衍生金屬氧化物從XRD 圖像上分析都與對應的M-Ti（M=Cr、Zr）氧化物峰相符，XRD表征符合預期設想。另外，在SEM 下的三種MOF-衍生金屬氧化物都呈大小近似球形的顆粒狀物，其中，兩種小配體（對苯二甲酸）的MOF-衍生金屬氧化物（Cr2O3@TiO2、（UiO-66）-ZrO2@TiO2）顆粒少量堆積形成豐富的多孔結構，而大配體（TCPP）的MOF-衍生金屬氧化物（（PCN-222）-ZrO2@TiO2）顆粒則大量聚集形成大孔隙的多孔結構。孔隙產生的原因可能在于高溫焙燒下有機配體的離去，形貌表征也符合預期設想，表征結果表明材料合成成功。

圖1 三種MOFs 基質的SEM 和XRD 表征Fig.1 SEM and XRD characterization of three MOFs matrix

2.2 MOF-衍生金屬氧化物作為MALDI-TOF MS 基質的探究

參考評估MOF-衍生金屬氧化物作為MALDI基質檢測氨基酸類小分子的表現[31,34?39]，選擇4 種氨基酸（Pro、Ile、His 和Try）作為目標分析物（圖2）進行MALDI-TOF MS 分析。

在進行MALDI-TOF MS 分析檢測時，正離子模式下，樣品常出現正離子加合峰，如加質子峰、加H+峰、加堿金屬離子峰（Na+或K+）、減電子峰等。圖3 為正離子模式下使用0.1 mg·mL?1三種MOFs（MIL-101（Cr）、PCN-222（Zr）、UiO-66（Zr）），作為基質用于MALDI-TOF MS 檢測0.1 mg·mL?1四種氨基酸的結果。三種MOFs 基質都在138.41（Pro 的[M+Na]+）、154.36（Ile 的[M+Na]+和Pro 的[M+K]+）、194.31（His 的[M+K]+）、243.30（Try 的[M+K]+）處產生清晰的正離子峰（表1），四種氨基酸均有特征峰被檢出，但三種基質的質譜圖背景不干凈，信噪比較低，且目標峰強度也不高。

如圖4 所示，三種MOF-衍生金屬氧化物在同等檢測條件下相比其前驅體MOFs 對四種氨基酸都有明顯更強的質譜信號檢出，信號強度和信噪比均提升了數倍到數十倍不等，且三種衍生金屬氧化物都檢測到清晰的堿金屬加合峰（表1）。其中，Cr2O3@TiO2（圖4A）對194.32 m/z 和178.36 m/z 檢出信號強度相較其他衍生金屬氧化物較強，且整體檢出強度和信噪比都較好；（PCN-222）-ZrO2@TiO2（圖4B）檢測效果相較于其前驅體MOFs 有明顯提升，但提升效果不如Cr2O3@TiO2基質（圖4A）；而（UiO-66）-ZrO2@TiO2（圖4C）峰強度較前驅體MOFs 雖有提升，但信噪比與其他衍生金屬氧化物相比稍差。

圖4 三種MOFs 及其衍生金屬氧化物（0.1 mg·mL?1）對4 種氨基酸的質譜檢測信號對比Fig.4 Comparison of the mass spectrometry of four amino acids in three MOFs matrix (0.1 mg·mL?1) and three MOFderived oxides metal matrix (0.1 mg·mL?1)

表1 各種基質對四種氨基酸的檢出表（正離子模式）Table 1 The table of four amino acids detected by various substrates (positive ion mode)

如圖5 所示，與TiO2NPs 相比，MOF-衍生金屬氧化物各目標峰檢出情況雖然有所差別，但所有目標峰均有檢出，信噪比和強度也較高，整體檢出效果相較于TiO2NPs 略微提升。這一結果應證了模板化合成的MOF-衍生金屬氧化物繼承了TiO2NPs 作為基質輔助分析物電離的優良效果，并且還具有更高的電離分析物效率。

圖5 三種MOF-衍生金屬氧化物（0.1 mg·mL?1）和TiO2 對4 種氨基酸的質譜檢測信號對比Fig.5 Comparison of the mass spectrometry of four amino acids in three MOF-derived metal oxides matrix (0.1 mg·mL?1)and TiO2 NPs matrix (0.1 mg·mL?1)

2.3 基質用量對質譜峰強度的影響

質譜中峰的高度與被測物的豐度有關，基質輔助被測物離子化效率越高，被測物進入探測器的豐度越高，峰強也就越高。由圖6 可知，Cr2O3@TiO2和（PCN-222）-ZrO2@TiO2基質在0.001～0.1 mg·mL?1的濃度范圍內，基質濃度的提升，增強了分析物的電離效率，但較高的基質濃度使基質與分析物結晶層變厚，激光不易于充分電離分析物與基質的共結晶，因此電離效率提升并未呈線性增長。（UiO-66）-ZrO2@TiO2基質未出現類似變化，但該基質在低濃度條件下針對四種氨基酸的電離效率明顯高于其他兩種MOF-衍生金屬氧化物。

圖6 不同濃度的Cr2O3@TiO2 （A）、（PCN-222）-ZrO2@TiO2（B）和（UiO-66）-ZrO2@TiO2（C）對4 種氨基酸的質譜檢測信號對比Fig.6 Comparison of the mass spectrometry of four amino acids in different matrix concentrations of Cr2O3@TiO2 (A),(PCN-222)-ZrO2@TiO2 (B) and (UiO-66)-ZrO2@TiO2 (C)

2.4 重現性與定量分析

到目前為止，已經開發出的金屬氧化物[7?9]和MOFs[10?11]基質中，只有在基質和分析物在局部形成的共結晶（即“甜點”）處才能獲得較好的檢測結果，阻礙了MALDI-TOF MS 在定量分析方面的應用。因此，本文中進行了MOF-衍生金屬氧化物重現性的分析工作，探究該新型基質材料在MALDI-TOF MS 檢測中是否具有對氨基酸類小分子較好的定量分析應用前景。

重復性通過采集3 個MOF-衍生金屬氧化物樣品的4 個隨機區域的數據進行評估（圖7），并將結果與TiO2NPs 基質樣品作比較。從信號強度上看，MOF-衍生金屬氧化物比TiO2NPs 基質具有更好的重現性，在樣品的不同區域上得到的信號峰強度差別不大。

從信噪比（表2）上分析，采用了4 個樣品在正離子模式下的信噪比相對標準偏差（RSDs）（n＝5）進行比較。表中可以看到，三種MOF-衍生金屬氧化物各個目標峰的RSD 都要明顯低于TiO2NPs（Cr2O3@TiO2在243.30 m/z 的信噪比RSD 20.74%除外）。值得注意的是，三種合成材料基質在某些目標峰檢出上有一定良好重現性表現：如Cr2O3@TiO2在138.41 m/z（Pro）、154.36 m/z（Pro、Ile）的信噪比RSD 只有4.72%和2.56%；（PCN-222）-ZrO2@TiO2在154.36 m/z（Pro、Ile）的信噪比RSD 為8.62%；（UiO-66）-ZrO2@TiO2在227.34 m/z（Try）的信噪比RSD 只有3.94%。

表2 MOF-衍生金屬氧化物樣品和TiO2 NPs 檢測4 種氨基酸信噪比RSDTable 2 S/N RSD of four amino acids using MOF-derived metal oxide and TiO2 NPs as matrix

進一步以Ile 和His 作為目標小分子，探究Cr2O3@TiO2基質的定量分析能力。不同濃度的Ile 和His在0.1 mg·mL?1Cr2O3@TiO2基質作用下的質譜結果如圖8 所示（S/N>10）。質譜峰信號強度和氨基酸的濃度呈線性關系（圖9）：在正離子模式下，Ile 的線性濃度范圍為0.001～0.1 mg·mL?1（R2=0.9997）；His的線性濃度范圍為0.001～0.1 mg·mL?1（R2=0.9997）。

圖8 不同濃度Ile 和His 在Cr2O3@TiO2 基質作用下的質譜信號Fig.8 The mass spectrometry of Ile and His at different concentrations using Cr2O3@TiO2 as matrix

圖9 Ile（A）與His（B）的線性關系圖（以Cr2O3@TiO2 為基質，測定不同濃度的分析物）Fig.9 Linear relationship plots of Ile (A) and His (B)(Cr2O3@TiO2 was used as matrix for the determination of different concentrations of analytes)

2.5 分析方法對比

綜合數據分析，MOF-衍生金屬氧化物相較于原MOFs 和TiO2NPs 作為基質在MALDI-TOF MS 分析中具有信號強度和信噪比上的優越性。其中，用Cr2O3@TiO2基質定量檢測Ile 和His，并與其他方法做了比較（表3），說明Cr2O3@TiO2基質在Ile 和His 定量檢測上有更好的應用前景。

表3 不同方法對Ile 和His 的檢測能力比較Table 3 Comparison of detection ability of different methods for Ile and His

3 結論

本文從模板化合成涂覆TiO2的MOF-衍生金屬氧化物材料入手，探究該材料作為基質在MALDITOF MS 檢測氨基酸類小分子代謝物中的效果。結果表明，MOF-衍生金屬氧化物材料在去除MOFs 有機結構的同時保持其結構特性，一方面消除該類基質在MALDI-TOF MS 分析中低分子量區域內的基質干擾，另一方面保留MOFs 及TiO2納米粒子本身的基質特性。這種材料解決了金屬氧化物基質檢測重現性差的問題，作為MADLI 基質相比原MOFs 及TiO2納米粒子在對氨基酸類小分子進行分析時表現出更優秀的性能，可以明顯提高小分子目標物的電離效率和檢測結果的信噪比，實現氨基酸類小分子代謝物的同時精確檢測，具有進一步拓展和應用的價值。