生物炭對設施連作土壤真菌群落結構與多樣性的影響

王雪玉 劉金泉 胡 云 田 勇 田 鳳 李 明

(內蒙古農業大學職業技術學院， 包頭 014109)

0 引言

隨著設施蔬菜產業的不斷發展，設施蔬菜種植土壤也隨之不斷退化。尤其是一些長時間連作的設施蔬菜種植地，土壤退化現象日趨嚴重，從而影響了設施蔬菜產業的可持續發展。近年來，各類以作物秸稈為主要原材料的營養基質逐步代替土壤進行蔬菜栽培，同時，將作物秸稈燃燒炭化后形成的生物炭作為一種新型解決連作障礙栽培方式，受到了國內外許多研究者的關注[1-5]。

生物炭是秸稈原料在低氧高溫下裂解炭化制備的新型環境友好型土壤改良劑，并且在農業土壤改良中起到了積極作用[6-8]。研究表明，生物炭還可以通過改變土壤微生物群落的結構組成以及微生物物種的豐富度來改變土壤養分的循環及結構[9-10]。隨著現代農業機械化產業的發展，許多農業生產活動，如過量無機肥的施入、大量地膜殘留以及過量農藥殘留等，導致土壤中微生物群落結構的嚴重破壞，并且在一定程度上減少了土壤中微生物的數量及微生物的多樣性[11]。生物炭因其自身特殊結構及性質使其具有巨大的比表面積和較高的孔隙度，從而成為土壤中眾多微生物棲息場所，不僅如此，生物炭由于含有特殊的有機物質，在微生物生長代謝中提供部分營養物質。因此，添加生物炭可以有效地改善土壤微生物的性質及群落結構[12]。

真菌作為一種微生物廣泛存在于土壤中，占地下總微生物量的81%～95%，在植物與土壤之間、土壤與大氣之間碳循環中發揮著重要作用，在土壤中有分解部分有害生物及有毒物質的作用，且能在生物炭的孔隙中更好地生長、繁殖[13]，因此，生物炭的添加可以增加真菌豐度，提高土壤真菌與細菌豐度比[14-15]。BAMMINGER 等[16]通過對溫帶農田土壤中施加2%的生物炭，發現生物炭可同時提高土壤中真菌和細菌的比例。MUHAMMAD等[17]將不同材料制成的生物炭添加到砂質壤土中，結果表明土壤真菌豐度顯著增加，同時發現真菌豐度及真菌與細菌豐度比隨著生物炭用量的增加而呈增加趨勢。

目前，關于生物炭對土壤改良、肥力提升及土壤微生物群落結構方面的影響已有很多報道[18-20]。關于生物炭對微生物影響的研究主要集中在微生物量、微生物群落結構、微生物功能、土壤酶活性[21-23]等方面。近年來土壤健康問題越來越受到重視，設施蔬菜土壤的健康狀況成為關注和需要解決的瓶頸問題。不健康土壤會導致土傳病害的連年發生，對植物的生長發育造成一定的危害，并且導致產量和品質下降[24]，微生物在土壤營養物質循環中起著主要作用，同時提供重要的生態系統服務功能[25]。基于此，本文針對設施連年種植蔬菜土壤質量退化現狀，通過對不同種植年份的土壤分別添加同量的玉米秸稈生物炭，研究土壤真菌群落變化規律及真菌多樣性，為生物炭改善設施土壤質量提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗于2021年4—7月和9—12月在內蒙古農業大學職業技術學院園藝園林實踐教學基地日光溫室進行。試驗日光溫室為水蓄熱內保溫裝配式結構，南北跨度為9 m，東西長度為50 m。生物炭由河南立澤環保科技有限公司提供，類型為玉米秸稈炭，有機碳質量比404.02 g/kg，全氮質量比8.36 g/kg，全磷質量比2.33 g/kg，全鉀質量比15.43 g/kg，pH值7.85。

1.2 試驗方法

通過盆栽試驗方法，分別取連續種植0、1、5、10、15、20年蔬菜土壤，每公頃均勻施入20 t生物炭，共6個處理，分別用CK、L1J、L5J、L10J、L15J、L20J表示。于2021年4月10日及9月20日定植嫁接黃瓜“德爾3號”幼苗，每個處理10盆，重復3次，于結果末期取根系周圍土壤，測定各項指標。

1.3 項目測定

1.3.1高可變區引物設計和PCR擴增

ITS測序使用的文庫構建步驟遵循Illumina測序儀文庫構建方法。本次測序以TS2為目標區域進行引物設計，利用DNA模板50 ng、25 μL的PCR體系，使用Pbusion酶擴增2～35個循環，引物序列為：fITS7 GTGARTCATCGAATCTTTG和ITS4 TCCTCCG CTTATTGATATGC。

1.3.2Illumina測序文庫構建(加入接頭)

由于一次上機的樣本數較多，一輪PCR擴增反應之后，需要在正反引物兩端分別加上不同的Barcode以區分不同的樣本。擴增完成后的PCR產物使用Reads純化之后進行上機測序。

1.3.3歸一化處理

PCR產物用AxyPrep Mag PCR Normalizer 進行歸一化處理。

1.3.4上機測序

構建好的文庫上樣到cBot或簇生成系統，用于簇生成及MiSeq測序。

試驗測序分析針對Illumina MiSeq 2×300 bp paired-end測序數據進行分析。對于MiSeq 測序獲得的雙端數據，首先根據Barcode信息進行樣品區分，然后根據Overlap關系進行Merge拼接成Tag，接著對拼接完成的數據進行數據過濾，隨后進行Q20、Q30等質控分析。對最終獲得Clean數據進行OTU聚類分析和物種分類學分析。

1.4 數據優化、分析與統計

先對原始數據進行如下處理：①去除Reads的Barcode和接頭序列。②將每一對Paired-end Reads拼接合并成一條更長的Tag。③去除含有N(N表示無法確定堿基信息)的比例大于5%的Tags。④去除低質量Tags(質量值Q<10的堿基數占整個Tag的20%以上)。從而得到Clean數據以進行后續分析。

試驗部分原始數據采用Excel 2003軟件整理，采用RDP(Ribosomal database project)11.3數據庫對真菌進行分類及群落結構分析，分類的置信度閾值為0.8。

2 結果與分析

2.1 生物炭對土壤真菌群落結構的影響

由圖1可以看出，同一個物種在不同樣品中的變化，同時可以看出各個物種的表達量及樣品序列的百分比。從門分類水平上各處理的物種表達量來看，對已知的真菌種類來說，子囊菌門(Ascomycota)的表達量最高，占總數的58.8%，其次是擔子菌門(Basidiomycota)，占總數的10.0%，表達量最少的是球囊菌門(Glomeromycota)，占總數的0.3%。從門分類水平上各物種在各處理中的樣品序列百分比來看，在已知的真菌種類中，子囊菌門(Ascomycota)在L10J及CK所占比例最多，分別為78.9%及76.0%，L15J中比例最小，為21.7%，最高處理與最低處理間存在較大差異；擔子菌門(Basidiomycota)在L15J處理所占比例最多，為39.9%，在L10J處理含量最少，為0.7%，最高處理與最低處理間存在較大差異；壺菌門(Chytridiomycota)在L1J處理比例最多，為3.7%，在L20J處理比例最少，為0.1%，最高處理與最低處理間存在較大差異；球囊菌門(Glomeromycota)在各個處理的比例均非常少，其中在L1J處理比例為0.7%，相比其他處理來說含量最高，在L15J、L20J及CK處理均未發現球囊菌門；接合菌門(Zygomycota)在L15J處理比例最多，為14.7%，在L10J比例最少，為1.9%，最高處理與最低處理間存在較大的差異。

圖1 不同處理物種區域圖Fig.1 Regional map of different treated species

為了更直觀地反映物種的豐富度及相似性，將門分類水平上的物種信息使用Heatmap(熱圖)表現(圖2)。在門分類水平上，施加生物炭后顯著增加了子囊菌門(Ascomycota)在各處理中的豐富度，而且在L10J處理的豐富度最高，其次是CK、L1J、L20J，在L15J處理豐富度最低；在一定程度上提高了擔子菌門(Basidiomycota)在L15J處理的豐富度。經聚類分析進一步表明，擔子菌門(Basidiomycota)在各處理中相對來說屬于物種較高的一類，其次是接合菌門(Zygomycota)，且兩個菌群聚為一類；從各處理的聚類分析來看，L5J、L20J、L1J、CK及L10J的物種數都比較豐富，且在這幾個處理中擁有相同的物種，但每個處理的物種豐富度各不相同。

圖2 不同處理門分類水平上的分類熱圖Fig.2 Classification heatmap at different processing gate classification levels

2.2 生物炭對土壤真菌多樣性的影響

相對豐度(Rank abundance)曲線用來說明多樣性的兩方面：物種的豐度和均勻度。從曲線水平方向來看，曲線寬度反映物種豐度，曲線在橫軸上寬度越大，則代表物種豐度越高；曲線形狀(平滑程度)反映樣品中物種均勻度，曲線越平緩，物種分布就越均勻。從圖3可以看出，各處理在OTU相對豐度為10-4時的物種豐度都比較高，最高的為L1J，L20J、L10J、CK次之，且在OTU相對豐度為10-4時的物種分布相對均勻；隨著OTU所含序列數的增加，物種的豐度逐漸下降，物種均勻度也隨之降低。總體來說，L1J處理的物種豐度最高、物種分布最均勻，顯著高于對照。

圖3 不同處理等級豐度曲線Fig.3 Abundance map of different treatment grades

Alpha多樣性通常用于度量群落生態中物種的豐度，測定土壤真菌Alpha多樣性，結果如表1所示。由可視指數可知，各處理的物種數均很豐富，其中以L10J處理顯著增加土壤真菌可視指數多樣性,其他各處理與對照相比，在一定程度上降低了土壤真菌的可視指數多樣性；從超指數來看，L10J的指數值最大，為692.00，說明L10J的物種總數最多，其次為CK，為613.13，物種總數最少的處理為L20J，為372.19；辛普森指數代表物種的多樣性，從辛普森指數來看，物種多樣性最高的處理是CK，為0.93，最低的處理是L1J，為0.51，各處理與對照相比，都在不同程度上降低了真菌的豐度；香濃指數同樣也代表各處理中物種的多樣性，從香濃指數來看，多樣性最高的為L10J，為6.81，與對照相比，顯著增加了真菌物種多樣性，多樣性最低的處理為L5J，為4.19，其他處理在不同程度上降低了真菌的物種多樣性。

表1 根際土壤真菌Alpha指數Tab.1 Alpha index of rhizosphere soil fungi

2.3 土壤真菌OTU聚類分析

通過OTU分析，可以知道處理中微生物多樣性和不同微生物的豐度利用。venn圖可用于統計多個處理中所共有和獨有的OTU數目，可以比較直觀地表現土壤環境中各處理中的OTU數目組成相似性及特異性。由圖4可知，L15J與L20J之間共有微生物數目為22個，其中L15J獨有的微生物數目為184個，L20J獨有的微生物數目為206個；L15J與L5J之間所共有的微生物數目為33個；L20J與L5J之間所共有的微生物數目為41個；L15J、L5J、L20J 3個處理之間共有微生物數目為72個，L5J獨有的微生物數目為152個。CK與L10J之間共有的微生物數目為10個，與L15J之間共有的微生物數目為25個，與L1J之間共有的微生物數目為23個；L10J與L5J之間共有的微生物數目為14個，與L1J之間共有的微生物數目為15個；L5J與L1J之間共有的微生物數目為15個；CK、L10J及L5J之間所共有的微生物數目為18個，L10J、L5J及L1J之間所共有的微生物數目為7個，CK、L1、L5J之間所共有的微生物數目為16個，CK、L10J、L1J之間所共有的微生物數目為12個；4個處理之間共有的微生物數目為70個；CK獨有的微生物數目為198個，L5J獨有的微生物數目為133個，L10J獨有的微生物數目為130個，L1J獨有的微生物數目為165個。從上述結果可以看出，L20J特有微生物數目比CK增加了8個，說明在生物炭的添加下可以增加L20J土壤中微生物的數量；L15J、L5J、L20J 3個處理之間共有微生物數目最多，為72個，說明生物炭添加下能夠縮小L15J、L5J、L20J 3個處理之間微生物的多樣性差異。

圖4 不同處理OTU分布venn圖Fig.4 The venn diagram of OTU distribution for different treatments

物種累積曲線可預測抽樣量是否充分，并可以預測所有處理中物種的豐度，橫坐標代表抽取的樣品數量，縱坐標代表抽樣后OTU數目，結果展示持續抽樣下OTU(新物種)出現的速率，在一定范圍內，若曲線表現為急劇上升則表示環境中隨著樣品量的加大有大量新物種被發現，當曲線趨于平緩，則表示此環境中的物種并不會隨樣品量的增加而顯著增多。從真菌的物種累計曲線來看(圖5)，在200～400個OTUs時有大量真菌的新物種出現，隨著樣品數量的增加，新物種的數量也隨之增加，但是增加不顯著，在1 000個OTUs時新物種的出現速率呈下降趨勢。

圖5 生物炭處理下物種累計曲線Fig.5 Species accumulation curve under biochar treatment

2.4 科分類水平土壤真菌豐度分析

表2為各處理在科分類水平上各真菌的豐度。從表中可見，在科分類水平上，從各科群落占總物種比例來看，未識別科、Incertae sedis 27、小子囊菌科(Microascaceae)、毛球殼科(Lasiosphaeriaceae)、爪甲團囊菌科(Onygenaceae)以及擔子菌門糞銹傘科(Bolbitiaceae)在總物種比例中相對較高，分別占物種總數的比例為9.4%、5.0%、5.0%、3.5%、3.7%、2.2%，構成了土壤中的優勢菌群；從各處理在這些優勢菌群中的比例來看，L10J、L15J 處理均可顯著提高上述菌群不同科分類水平的豐度。

表2 真菌在科分類水平的豐度比較Tab.2 Comparison of fungal species abundance at level of classification in class

3 討論

秸稈生物炭不僅是富含碳的有機物質，還包括氮、氧、硫等多種養分元素和無機碳酸鹽成分，其施入土壤中可以增加土壤有機碳含量，并能提供微生物可利用組分[26]， 微生物在土壤生態系統的物質循環和能量流動過程中發揮著重要的作用，它可以直接或間接參與生物炭在土壤中的降解、遷移和轉化過程[27]；生物炭作為一種性質獨特的物質，其孔隙結構及對水肥的吸附作用可直接為土壤微生物提供良好的棲息環境和生長所需養分[28-29]。與細菌相比，真菌在土壤中以多種方式吸收營養，土壤環境發生變化，部分真菌會迅速改變自身的營養方式，以對抗因環境變化帶來的不利影響，這是一種較高的生存策略[30]。本試驗中，經生物炭處理的土壤均在一定程度提高了部分有益真菌的菌群數量，擔子菌門在土壤中通常會與植物根系共生形成菌根，有利于植物生長，所以屬于優勢菌群，本試驗中擔子菌門的表達量占10.0%，在門分類水平上與對照相比，增加了有益菌群擔子菌門(Basidiomycota)及接合菌門(Zygomycota)在L15J處理中的比例，降低了不利菌群壺菌門在L15J處理中的比例，而壺亞門屬于高等植物上的寄生物，會引起玉米褐斑病及馬鈴薯癌腫病等，所以屬于不利菌群；通過不同處理在門分類水平上分類熱圖進一步可以看出，生物炭處理下均在不同程度上提高了各處理優勢菌群擔子菌門的比例。綜合來看，以種植15年蔬菜土壤(L15J)添加生物炭效果最為顯著，這為設施蔬菜土壤改良提供理論依據。

施加生物炭可以改變土壤環境，進而促進微生物群落組成和結構的改變[31]。通過對不同處理物種等級豐度分析及Alpha多樣性分析表明，施加生物炭后提高了連作蔬菜土壤中真菌的多樣性，其中以L1J處理的物種等級最高，而且在OTU豐度為10-4時物種分布最均勻；從Alpha指數來看，各處理以L20J中的物種數量最多、豐度最高，表明在一定的生物炭處理下，能夠增加種植20年蔬菜土壤中的真菌多樣性及真菌豐度，這與前人的研究結果一致[32]。土壤真菌OTU聚類分析表明：在對所有處理樣本進行聚類后，所有樣本平均OTU數目為166.85，以L20J獨有的真菌數目最多，為206個，說明連作20年土壤中真菌數量具有特異性；其次是 L15J，為184個，獨有真菌數目最少的處理為L10J，為130個，各處理之間共同擁有的真菌數量為70個及72個，說明各處理之間擁有真菌多樣性的差異比較小，同時可以看出，隨著種植年限的增加，土壤中的菌群特異性隨之增加，并且在200～400個OTUs時有大量真菌的新物種出現，在1 000個OTUs時新物種的出現速率呈下降趨勢，這一試驗結果既在前人的研究基礎上得到了進一步的補充和創新，又為后期的研究奠定了基礎。

4 結束語

通過盆栽試驗，利用高通量測序技術分析了不同種植蔬菜年限土壤經一定量的生物炭處理后的真菌群落結構，結果表明：通過對不同種植蔬菜年限的土壤施入一定量的生物炭處理后，改變了土壤真菌群落結構，影響了土壤真菌菌群的物種數量，并且在一定程度上提高了部分有益菌群擔子菌門(Basidiomycota)及接合菌門(Zygomycota)的豐度及多樣性，綜合來看,以 L15J及L20J處理中優勢菌群豐度及物種多樣性最高，同時降低了部分有害菌群壺菌門(Chytridiomycota)的豐度及多樣性。