人參單體皂苷藥性(氣)評價方法研究

張曉桐, 劉雪瑩, 劉琳琳, 冉小庫, 竇德強

(遼寧中醫藥大學藥學院,遼寧 大連 116600)

中藥藥性理論是中藥最重要的基本理論之一,目前對中藥單體有效成分藥性的研究仍不完善,結合早期學者提出的“藥性分子假說”中對有效成分藥性的闡釋[1],以及其后匡海學等[2]提出的“中藥性味理論新假說”中提倡的從有效成分層面探討中藥藥性,基于以上假說和思想,我們推測作為人參屬中藥中主要有效成分的人參單體皂苷也應該具有各自相應的藥性(氣),并期望建立出人參單體皂苷的藥性(氣)評價方法。考慮到臨床經驗總結分析中藥藥性對機體的生理功能有不同作用,本實驗室前期對中藥藥性與細胞增殖關系的研究[3],以及研究者對中藥藥性與能量代謝關系的研究[4],本研究擬通過進行人參單體皂苷與藥性相關性分析,并測定人參皂苷對人肝細胞LO2與豬大腦皮層Na+/K+-ATPase活力影響來評價人參單體皂苷藥性。若本研究結果與中醫臨床理論一致,與現有研究成果一致,即溫熱藥性的人參單體皂苷呈興奮作用,寒涼藥性的人參單體皂苷呈抑制作用,則表明該評價方法可行,從而提出人參單體皂苷的藥性(氣)評價方法。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑人肝細胞LO2(中國科學院上海細胞庫)；豬大腦皮層ATPase(批號：SLBN7649V 美國Sigma)；人參皂苷R-Rg3、Ro、Rb1、Rd、Re、Rg1、F11、Rf、Rb2、Rb3、Rc、Rg2、Rh1、三七皂苷R1和齊墩果酸(OA)均為本實驗室分離自制,純度均>95%；R-Rh2(批號：HG027746198 寶雞市辰光生物科技有限公司)；去乙酰毛花苷注射液(批號：161105上海禾豐制藥有限公司)；四甲基偶氮唑藍(批號：1117X0514北京Solarbio公司)；二甲基亞砜(批號：520C0313 美國SIGMA公司)；RPMI1640培養基(批號：8117244美國Gibco公司)；0.25%胰蛋白酶(批號：1860129 美國Gibco公司)；胎牛血清(批號：1050B5061 上海李記生物科技有限公司)；雙抗(批號：J160035美國Hyclone公司)；PBS磷酸鹽緩沖液(批號：1016K022 北京Solarbio公司)；超微量Na+/K+-ATPase試劑盒(批號：20180529南京建成)；總ATPase試劑盒(批號：20171219南京建成)；蛋白定量試劑盒(批號：20180504南京建成)

1.2 儀器可調式移液器(美國RAININ公司)；KQ-250DE超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；UV-2100 紫外分光光度計(上海UNICO公司)；HH-S型電熱恒溫水浴鍋(鞏義市予華儀器有限責任公司)；NU-4750型CO2培養箱(美國NUAIRE公司)；HD2-BCN-1360B生物潔凈工作臺(北京東聯哈爾儀器制造有限公司)；AE31EF型倒置顯微鏡(Motic公司)；Caretium酶標儀(深圳市凱特生物醫療電子科技有限公司)；U570-86 Premium系列超低溫冰箱(-80 ℃)(美國NBS公司)；TDZ4-WS低速臺式離心機(湘儀離心機)；濾器(0.22 μm)(Millex.GP)；96孔無菌培養板(Corning公司)；6孔無菌培養板(Corning公司)；BXM-30R型立式壓力蒸汽滅菌器(上海博迅實業有限公司)

1.3 主要試劑的配制(1)10% RPMI1640培養液：取適量RPMI1640培養基,并加入1%雙抗和10%于56 ℃滅活胎牛血清,0.22 μm濾膜過濾,4 ℃冰箱保存備用。(2)MTT溶液：稱取50 mg MTT,用10 mL的PBS(pH 7.4,0.01 mol·L-1)將MTT溶解,用0.22 μm的微孔濾器過濾除菌,分裝,-20 ℃避光保存備用。(3)待測液的配制：各單體皂苷儲備液采用DMSO配置,-20 ℃冷凍保存備用。

1.4 利用雙變量相關分析評價人參皂苷藥性(氣)通過檢索關于三七、紅參、人參、西洋參、人參葉皂苷含量測定相關文獻[5-6],收集整理5種中藥中Rg1、Re、Rb1、Rc、Rb2、Rd、Rg2、Rf、Ro、Rg3、F11、R1含量數據,依據中國藥典中含量測定項下規定,剔除不滿足藥典規定樣品,得出滿足藥典規定的每種中藥各十批樣品中皂苷類成分含量數據(Tab 1)。同時將藥性賦值[7],即寒-2、涼-1、微溫0.5、溫1。將藥性屬性由寒到溫依次從小到大編秩,相同藥性秩次X相加求平均值得秩次Y,如Tab 2所示,將各藥材皂苷含量及藥性錄入SPSS 17.0軟件,做雙變量相關分析,得出藥性(氣)與各皂苷含量之間相關性。

Tab 1 Content data of ginsenosides in Panax notoginseng, red ginseng, ginseng, American ginseng and ginseng leaves

Tab 2 Assign value by characteristics

1.5 利用灰色關聯度法評價人參皂苷對人參屬五種中藥藥性(氣)的貢獻為評價各成分貢獻大小,原始數據的變換采用初值化變換法。以中藥藥性賦值作為母序列(賦值分別為寒-2、涼-1、微溫0.5、溫1),中藥中各批次的成分含量作為子序列。按照灰色關聯度計算方法計算灰色關聯度。

1.6 利用網絡藥理學預測不同藥性的人參屬五種常用中藥對于代謝通路的調節作用

1.6.1人參屬五種常用中藥主要活性成分提取 利用中藥系統藥理學數據庫與分析平臺TCMSP (http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php),以口服生物利用度(OB)≥30%和類藥性(DL)≥0.18作為閾值對結果進行篩選,分別查找5種中藥的主要活性成分及與主要活性成分相關的潛在靶點。

1.6.2人參屬五種常用中藥中皂苷成分提取 利用數據庫TCMSP,分別查找5種中藥中皂苷成分及與其相關的潛在靶點。

1.6.3人參屬五種常用中藥靶點預測 利用TCMSP數據庫和SwissTargetPrediction (http：//www.swisstargetprediction.ch/)數據庫,將1.6.2項下獲得的活性成分轉化為標準SMILES格式,導入平臺分析,設置屬性為“homo sapiens”,將靶點概率值不小于0的分子作為該成分有效靶點。

1.6.4KEGG通路富集分析 利用R 3.6.3 (https：//www.r-project.org)軟件中Bioconductor (org.Hs.eg.db)合集對各藥材不同蛋白模塊的靶點進行KEGG 信號通路富集分析,分別得到五種中藥所涉及的代謝通路。在此基礎上,通過對比去重的方法剔除寒涼、溫性中藥共同涉及的代謝通路,得到寒涼性中藥和溫性中藥的特異性代謝通路。

1.7 人參皂苷對人肝細胞內Na+/K+-ATPase活力調控作用研究利用MTT法篩選對細胞無抑制作用人參皂苷濃度進行Na+/K+-ATPase活力測定,取對數生長期人肝細胞LO2,以1×108·L-1密度將其接種于6孔培養板上,每孔2 mL,置于5% CO2培養箱中培養 24 h待細胞貼壁后,更換新鮮培養液。分別加入含終質量濃度分別為1、10 μmol·L-1含人參皂苷R-Rg3、S-Rg3、Re、Rb1、Rg1、Rd、OA、Ro 和PPT 的培養液,空白對照組只加培養液,每個處理組設3個重復,繼續培養細胞48 h。將各處理組細胞用0.25%胰酶消化,1 000 r·min-1離心5 min收集細胞,生理鹽水洗2遍以除掉殘留的培養液或磷酸緩沖鹽溶液,棄上清,留下層細胞,用生理鹽水制備109-1010·L-1的細胞懸液(500 μL),經超聲波細胞破碎機破碎細胞后(功率10%,4 s/次,間隔8 s,重復8～10次),按照Na+/K+-ATPase試劑盒說明書進行測定,同時采用BCA法檢測細胞總蛋白濃度。

1.8 人參皂苷對豬大腦皮層ATPase活力調控作用研究分別將終蛋白濃度為12.5 mg·L-1的豬大腦皮層ATP酶與終濃度為100、10、1、0.1 μmoL·L-1的 Rb1、Rb2、Rb3、Rc、Rd、R-Rg3、R-Rh2、Ro、Re、Rg1、、Rf、Rg2、Rh1、三七皂苷R1、Deslanoside和齊墩果酸(OA)溶液混合后制成待測樣本,每個濃度設3個重復,按照Na+/K+-ATPase試劑盒說明書操作步驟進行。

1.9 數據處理數據采用2016 OFFICE EXCEL按照試劑盒說明書中公式進行計算后采用SPSS 17.0統計軟件,采用One-Way ANOVA進行比較。

2 結果

2.1 雙變量相關分析結果及灰色關聯度法評價結果當Kendall相關系數>0時表明與溫熱藥性相關,Kendall相關系數<0則與寒涼藥性相關(Tab 3)。其中與溫熱藥性相關的人參皂苷的相關程度順序為Rf>R1>Rg3>Rg2>Rb1>Ro,與寒涼藥性相關的人參皂苷的相關程度順序為Rb2>Re>Rd>F11,另外Rg1、Rc與寒熱藥性無顯著性相關,可能為平性。灰色關聯度分析結果表明,人參皂苷含量對人參屬中藥藥性的貢獻程度為F11>Re>Rg2>Rd>Rb2>Rb1>Rg1>Rc>Rg3>R1>Rf>Ro。

Tab 3 Bivariate correlation analysis results and grey correlation analysis results

2.2 網絡藥理學預測不同藥性的人參屬五種常用中藥對于代謝通路的調節作用檢索數據庫TCMSP,共篩選到三七成分20個,紅參19個,人參41個,西洋參27個,人參葉33個。經過KEGG信號通路富集分析,并對結果對比去重后,分別得到溫性和寒涼性藥物組特異性代謝通路27個和13個。由Fig 1～2可知,性溫的三七與紅參及性微溫的人參與AMPK信號通路、ErbB信號通路、FoxO信號通路與MAPK信號通路等相關,而性涼的西洋參與性寒的人參葉參與鈣信號通路、NOD樣受體信號通路與VEGF信號通路等相關。其中AMPK信號通路與ATP的生成與消耗相關,而ATPase在物質運輸、信息傳遞和能量代謝等方面起著重要作用,隨著Na+-K+-ATPase活力增加,能量消耗和熱量產生也隨之增加,因此進一步肯定了可以通過測定Na+-K+-ATPase活力評價藥性。

2.3 人參皂苷對人肝細胞內Na+/K+-ATPase活力調控結果由Fig 3B可知,人參皂苷Rg3、Re、Rd與Ro對肝細胞內Na+/K+-ATPase活力呈抑制作用,可能為寒涼藥性,人參皂苷Rb1、Rg1對其呈促進趨勢,可能為溫熱藥性,而OA對其無明顯作用,可能為平性。但考慮到Rg3與Ro的抑制作用可能與其細胞毒性有關(Fig 3A),細胞內Na+/K+-ATPase活力評價藥性有一定局限性,則后續利用市售豬大腦皮層ATPase對人參單體皂苷藥性進行評價。

2.4 人參皂苷對豬大腦皮層Na+/K+-ATPase活力調控結果以去乙酰毛花苷(Deslanoside)為陽性對照,由Fig 4可知,Deslanoside能有效抑制豬大腦皮層Na+/K+-ATPase活力,證實該酶活力正常。在0.1 ～100 μmol·L-1濃度范圍內,人參皂苷Rb1、Rb3、Rc、Rf、Rg2、Rg1與Rh1能夠增強Na+/K+-ATPase活力,而Rg3、R1與Ro在0.1 μmol·L-1時能夠增強Na+/K+-ATPase活力,但隨著濃度升高表現出抑制的作用。人參皂苷Rb2、Rd、Rh2、Re及OA均具有抑制Na+/K+-ATPase活力的作用,且隨著濃度增高,抑制作用增強。

Fig 1 Effective components of warm ginseng traditional Chinese medicine - key targets - pathway diagram

Fig 2 Effective components of cold ginseng traditional Chinese medicine - key targets-pathway map

Fig 3 Effect of ginsenoside on proliferation of human hepatocytes(A),and effect of ginsenoside on Na+/K+-ATPase activity in human hepatocytes (B)

Fig 4 Effect of ginsenoside on Na+/K+-ATPase activity in porcine cerebral cortex

Fig 5 Average content of saponins in Panax notoginseng, red ginseng, ginseng, American ginseng and ginseng leaves

基于該實驗評價人參皂苷藥性規律為,溫熱藥在低濃度條件下增強Na+/K+-ATPase活力,隨著濃度升高,其對Na+/K+-ATPase活力的影響可能表現為增強或抑制,而寒涼藥無論在何種濃度下,均抑制Na+/K+-ATPase活力。

3 討論

本實驗雙變量相關分析結果表明，與溫熱和寒涼藥性相關皂苷的相關程度分別為Rf>R1>Rg3>Rg2>Rb1>Ro和 Rb2>Re>Rd>F11。灰色關聯度分析結果表明，其貢獻程度順序為F11>Re>Rg2>Rd>Rb2>Rb1>Rg1>Rc>Rg3>R1>Rf>Ro。對Na+/K+-ATPase活力影響結果表明人參皂苷Rb1、Rb3、Rc、Rf、Rg2、Rg1、Rh1、Rg3、R1和Ro藥性呈現為溫熱,能增強Na+/K+-ATPase活力,人參皂苷Rb2、Rd、Rh2、Re和齊墩果酸藥性呈現為寒涼,能抑制Na+/K+-ATPase活力。

現有諸多文獻在中樞神經系統、自主神經系統、內分泌系統、機體物質代謝以及抗感染、抗腫瘤等方面均反映出各人參單體皂苷成分的藥性。通常溫熱藥性的人參單體皂苷對機體能量、物質代謝呈促進作用,寒涼藥性則呈抑制作用。現有研究表明，三七皂苷R1能通過恢復凋亡相關基因BAX與BCL2的平衡,保護大鼠皮質星形膠質細胞免于過氧化氫誘導的凋亡作用,人參皂苷Rg2能通過海馬BDNF信號通路興奮中樞神經系統從而發揮抗抑郁作用,Rf能有效緩解大鼠神經性疼痛的痛覺過敏反應中抑郁表現[8],反映出三七皂苷R1與人參皂苷Rg2、Rf溫熱的藥性。Rg3能調節表皮細胞增殖周期[9]。Ro 能劑量依賴性地增加急性運動挑戰后的握力和耐力游泳時間,顯著增加總蛋白、葡萄糖水平與腓腸肌糖原含量。Rf能顯著提高肝臟載脂蛋白A-Ⅰ和C-Ⅲ mRNA的基礎水平[10]。人參皂苷Rb1能夠通過增強術后疲勞綜合征大鼠骨骼肌中Na+-K+-ATPase和SDH的活性改善能量代謝[11],人參皂苷Rb3可提高SOD、Na+-K+-ATPase和Ca2+-Mg2+-ATPase活力,對大鼠實驗性腦缺血起明顯保護作用[12]。這種對能量代謝與物質代謝各種酶和產物的上調作用反映了Rg3、Ro、Rf、Rb1與Rb3的溫熱藥性。人參皂苷Rd、Re對神經膠質瘤細胞增殖表現為抑制,為寒涼藥性,而人參皂苷Rc的抑制作用不明顯[13],從側面反映出Rc并非寒涼藥性,結合Na+-K+-ATPase實驗結果分析Rc可能為溫熱藥性。而人參皂苷Rg1對多種中樞神經系統疾病具有治療作用,影響神經遞質的合成與釋放,促進神經細胞生長和神經干細胞分化等,也表現為溫熱藥性[14]。Rh2能通過抑制Na+/K+- ATPase促進血液循環[15],Rd能通過抑制血管平滑肌細胞的受體調控性及鈣通道介導的鈣內流降低血壓[16],還能減少ROS的生成從而減輕過氧化氫對星形膠質細胞的損傷,表現為寒涼藥性。此外,Rb2能降低總膽固醇,游離膽固醇、低密度脂蛋白、甘油三酯水平及中樞鎮靜作用。Re能夠顯著抑制人宮頸癌細胞的增殖,降低細胞內乳酸脫氫酶,琥珀酸脫氫酶,葡萄糖-6-磷酸脫氫酶和丙酮酸脫氫酶的活性。這些對物質代謝的抑制作用可能與Rb2、Re藥性寒涼有關。以上文獻表明,三七皂苷R1與人參皂苷Rg2、Rf、Rg3、Ro、Rf 、Rb1與Rb3藥性溫熱,而Rh2、Rd、Rb2與Re藥性寒涼,該分析結果與本研究結論相符,進一步從現有文獻的研究結果角度佐證了本研究結果的準確性,也說明了本評價方法有一定的可行性和客觀性。

另外,通過計算5種中藥中人參皂苷平均含量,發現三七中Rg1、Rb1及三七皂苷R1含量較高；而紅參中主要含有Rg1、Rb1、Re及稀有皂苷Rg3等[17]；人參中主要皂苷含量Rb1>Rg1>Re；西洋參中主要皂苷含量Rb1>Re>Rd>Rg1,其Rg1含量遠低于人參[18]；人參葉中主要含有Re、Rg1、Rd與Rb2,其中Re濃度較高(Fig 5)。另外根據《中國藥典》中含量測定標準,并結合相關分析與人參皂苷對Na+/K+-ATPase活力影響結果分析,發現三七性溫可能與溫熱藥性顯著相關的Rb1和R1以及能夠促進Na+/K+-ATPase活力的Rg1有關,紅參性溫可能與Rb1、Rg1有關,人參藥性可能與高含量的溫熱藥性顯相關的Rb1和促進Na+/K+-ATPase活力的Rg1及相對含量較低的與寒涼藥性顯著相關的Re有關,故表現為微溫。此外紅參中含有的稀有皂苷,如Rg3與溫熱藥性顯著相關,故紅參溫性強于人參。西洋參性涼可能與高含量的寒涼藥性顯著相關的Re、Rd及與溫熱藥性顯著相關的Rb1有關,其中Re與Rd在灰色關聯度中對藥性的貢獻程度均較高。而人參葉性寒可能與高濃度的與寒涼藥性顯著相關的Re、Rd與Rb2有關。因此可知溫熱藥性人參屬中藥中含Rb1、Rg1、R1較多,而寒涼藥性人參屬中藥中含Rb2、Rd、Re較多。以上結果一方面與匡海學等人提出的中藥性味可拆分性、可組合性理論相符合,進一步作證了中藥單體成分與單味藥相類似的也具有對應的藥性,并且其含量對人參屬各中藥的藥性產生一定影響,另一方面與本研究的結果相一致,說明本研究實現了從有效成分層面分析中藥藥性,為中藥藥性理論做出進一步補充。

綜合以上結果,人參皂苷的藥性(氣)評價可以利用Na+/K+-ATPase活力結合人參皂苷含量與中藥藥性相關性分析,該方法具有一定可行性。