新疆葡萄枝孢果腐病病原菌的鑒定及生物學特性

陳思穎, 焦瑞蓮, 李志強, 劉 政*, 李國英*

(1. 石河子大學農學院,新疆綠洲農業病蟲害治理與植保資源利用重點實驗室, 石河子 832003; 2. 新疆石河子開發區石大惠農科技開發有限公司, 石河子 832003)

我國是世界葡萄與葡萄酒生產大國,其中鮮食葡萄種植面積、產量均居世界第一位[1]。據國家統計局網站數據顯示,2019年,新疆葡萄產量為313.17萬t,占我國葡萄總產量的22.06%,成為全國最大的葡萄生產基地。2019年,在新疆石河子發現一種葡萄果實新病害,多發生在有傷口的成熟葡萄果實上,病部常形成橄欖綠色霉層,受害部位通常凹陷,最后失水皺縮干枯，易脫落,嚴重影響葡萄的品質。挑取葡萄病部橄欖綠色霉層在光學顯微鏡下觀察發現大量枝孢菌分生孢子。

枝孢菌廣泛分布于空氣、土壤、食品、水體中,可作為病原菌侵染多種作物,如辣椒[2]、柚[3]、葡萄[4-8]和棉花[9]等,少數種還可侵染動物和人類[10-13]。關于葡萄枝孢菌的研究,Briceo等[5]從智利山谷‘赤霞珠’葡萄上分離到枝孢菌,并將其鑒定為枝狀枝孢Cladosporiumcladosporioides和多主枝孢C.herbarum。2003年,Gabler等[6]發現葡萄品種的感病性和果皮的完整性對病菌的侵染有重要的影響。1992年,張國敏等[7]在我國首次發現枝孢菌危害葡萄果實,但未進行種的鑒定。隨后,翟鳳艷等[8]從葡萄葉片上也分離到綠色枝孢C.viride。目前在新疆未見枝孢菌危害葡萄果實的報道。本研究通過形態學鑒定、分子生物學鑒定和致病性測定,確定了危害新疆葡萄果實的枝孢菌種類,并對其生物學特性進行了初步研究。

1 材料與方法

1.1 病害調查及病樣采集

2019年8月底到9月上旬,在石河子地區葡萄園的‘無核紫’葡萄上,發生了一種嚴重的爛果病,經檢查病部表面有不少枝孢屬Cladosporium真菌的分生孢子。為進一步查明病害的發生情況,2020年9月上中旬,對南北疆11個葡萄園的枝孢果腐病進行了調查,記錄該病的典型癥狀,同時采集癥狀典型的病樣,供后續研究。

1.2 病原菌的分離、純化及代表菌株的選擇

采用常規稀釋分離法,對采集的病樣在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基(PDA)上進行病原分離和單孢純化,根據采集地點、葡萄品種、菌落形態、生長速度等選取代表性菌株,PDA試管斜面4℃保存,供后續試驗。

1.3 病原菌鑒定

1.3.1形態學鑒定

分離純化的21個代表性菌株接種在PDA培養基后,將無菌的蓋玻片以45°角斜插入培養基中(與接種菌塊距離為1.0～1.5 cm),在25℃條件下倒置培養5 d,待菌絲長過插片的位置后取出玻片,觀察分生孢子梗和分生孢子著生方式,并測量50個分生孢子大小;用掃描電子顯微鏡(日本HITACHI SU8010,加速電壓5 kV,工作距離8 mm)對枝孢菌獨特的孢痕結構、分生孢子梗和分生孢子表面紋飾進行觀察并拍照。按Bensch等[14]的方法進行形態鑒定。

1.3.2分子生物學鑒定

將純化后的21個供試菌株在PDA上,25℃培養10 d后用無菌刀片刮取菌絲體置于2 mL離心管中,用Biospin Fungus Genomic DNA Extraction Kit(杭州博日科技有限公司)提取DNA。采用真菌ITS1和ITS4、編碼肌動蛋白基因的ACT-512F和ACT-783R以及編碼翻譯延長因子基因的TEF1-728F和TEF1-986R為引物對試驗菌株基因組DNA進行PCR擴增[15-16]。擴增產物用1%瓊脂糖凝膠(rDNA-ITS)和2%瓊脂糖凝膠(ACT、TEF1-α)電泳檢測后,將PCR產物連接至測序載體pMD 19-T上,送至生工生物工程(上海)股份有限公司測序。獲得的序列在NCBI數據庫中進行BLAST比對,選取枝孢屬不同種同源性較高序列,利用軟件DNAMAN進行比對分析。以甜菜生尾孢Cercosporabeticola(ITS、TEF1-α和ACT登錄號分別是AY840527、AY840494和AY840458)作為外群,用MEGA 7.0軟件采用最大似然法進行系統發育樹的構建,確定其分類地位。

1.4 致病性測定

用分生孢子懸浮液噴霧接種和菌絲球接種兩種方法進行致病性測定。試驗選用從葡萄園采摘的‘新郁’葡萄果實,用75%乙醇對其表面進行消毒,再用無菌水沖洗3次,置于滅菌吸水紙上晾干,用小型無菌注射器針頭將果面輕微刺傷。

分生孢子懸浮液噴霧接種:以不針刺噴霧清水和針刺后噴霧清水作為對照,用濃度為1×107個/mL的孢子懸浮液進行噴霧接種,均勻噴霧3次以使果面完全濕潤。每個處理10粒葡萄,3次重復,保濕培養,每3 d觀察1次,記錄發病情況。對發病葡萄進行病原菌分離,觀察分離菌株與接種菌株異同。

菌絲球接種:打取5 mm直徑菌餅放入馬鈴薯液體培養基中,置于25℃搖床150 r/min培養2 d。用移液槍吸取大小一致的單個菌絲球置于果面的刺傷部位,并以不放置菌絲球為對照,保濕培養7 d后去除菌絲球,每個處理10粒葡萄,3次重復,7 d后記錄發病情況,并對發病果面進行再分離,觀察菌株與接種菌株的異同。

1.5 生物學特性測定

根據形態學和分子生物學鑒定結果,選擇C4和C10分別代表枝狀枝孢C.cladosporioides和檸檬形枝孢C.limoniforme,進行以下生物學特性的研究。枝孢菌產孢量大,用菌餅轉接極易在培養基上形成較多小菌落,因此生物學特性試驗采用菌絲球接種。

1.5.1溫度對枝孢菌生長和產孢量的影響

吸取大小一致的單個菌絲球(菌絲球獲得同1.4)轉接到PDA培養基上,分別置于5、10、15、20、25、30、35℃的培養箱中,黑暗恒溫培養。每組處理3個重復。14 d后測量菌落直徑并拍照,之后在菌落半徑的1/2處打取5 mm的菌餅,取2個菌餅置于2 mL離心管中,加入1 mL無菌水,充分振蕩,得到分生孢子懸浮液(下同)。然后按常規血球板計數法測定每個溫度下的產孢量,3次重復,求其平均值。

1.5.2光照對枝孢菌生長和產孢量的影響

將菌絲球轉接到PDA培養基上,分別置于完全光照(24 h光照)、完全黑暗(24 h黑暗)和光暗交替(L∥D=12 h∥12 h)3種處理的培養箱中,25℃培養14 d,測量菌落直徑,每組處理3個重復。產孢量的測定方法同1.5.1。培養皿距離光源25 cm,光照強度為5 000 lx。

1.5.3pH對枝孢菌生長和產孢量的影響

用HCl和NaOH將PDA培養基的pH分別調節為4、5、6、7、8、9、10后滅菌,然后在無菌條件下,將菌絲球置于上述不同pH的PDA培養基上,25℃黑暗培養14 d,測量菌落直徑,每組處理3個重復。產孢量測定方法同1.5.1。

1.5.4枝孢菌的致死溫度測定

設置水浴鍋溫度為40、45、50、55、60、65、70℃,將裝有1mL濃度為1×107個/mL的孢子懸浮液的離心管和裝有2個5 mm菌餅的離心管分別置于不同供試溫度的水浴鍋中處理10 min,取出冷卻至室溫后接種至PDA平板上,25℃黑暗培養5 d,根據PDA平板上是否有菌落生長確定其致死溫度的范圍,再以1℃為溫度梯度重復上述步驟,連續進行4次,確定其致死溫度。

1.6 數據分析

用Excel 2010進行試驗數據分析,用 SPSS 19.0對數據進行多重比較和方差分析。

2 結果與分析

2.1 田間調查采樣及癥狀描述

田間調查發現,葡萄枝孢果腐病在11個調查的葡萄園中均有發生,范圍較廣,霉層多出現在有傷口的成熟葡萄果粒上。該病一般在8月下旬葡萄成熟后發生,特別在蟲害較多、裂果較重、或存在傷口的果實上發生較多。受害部位通常凹陷,最初病斑為近圓形小點,后擴展至整個傷口,并在病部形成橄欖綠至褐綠色霉層,嚴重時導致整個果粒干枯。

2.2 病原菌的分離、純化及代表菌株的選擇

調查中共采集典型癥狀病樣80個,經分離共得到91個菌株。根據采集地點、葡萄品種、菌落生長速度等特點,選取代表性菌株21個,具體采樣地點和品種見表2。

表2 21個代表菌株的來源及相關信息Table 2 The origin and related information of 21 representative strains

2.3 病原菌鑒定

2.3.1形態學鑒定

供試21個菌株在PDA上25℃培養14 d后,菌落正面均呈深綠色或橄欖綠色,背面呈墨綠色;菌落呈絨毛狀或氈狀,菌絲有分隔,光滑或粗糙。光學顯微鏡下可見分生孢子梗單生,直立,有隔;分生孢子鏈狀,通常有多個分支,簇生或單生,有隔或無隔。分生孢子具有明顯帽(冠)狀結構的孢痕(圖1a4, 圖1b4)。根據菌落生長速度、分生孢子形狀、大小、表面紋飾將菌株分為兩類。

第一類:共20個菌株,在PDA培養基上生長較快,14 d后菌落直徑為52.5～72.0 mm。初期菌落正面為橄欖綠色,背面為墨綠色,邊緣白色至無色透明;后期菌落正面顏色由內至外呈綠色至灰綠色,培養基背面龜裂。菌落緊密呈絨毛狀,伴有同心輪紋。分生孢子梗直立或彎曲,單生,有隔,大小(41.36～269.76)μm×(3.27～5.84)μm。分生孢子多鏈生或單生,無隔或有隔,一般每鏈5～7個分生孢子,最多8個分生孢子。分枝分生孢子圓柱形、近卵圓形,大小(8.78～28.66)μm×(2.55～4.58)μm;次級分枝分生孢子卵圓形、長橢圓形,大小(4.70～14.92)μm×(1.57～4.73)μm;中間分生孢子卵圓形、紡錘形,大小(4.57～10.11)μm×(2.57～4.38)μm;末端分生孢子卵圓形、近圓形,大小(2.90～8.19)μm×(1.69～3.50)μm。在掃描電鏡下,可觀察到分生孢子表面具有不規則網狀紋,其形態特征與枝狀枝孢Cladosporiumcladosporioides一致(圖1：a1～a4)。

圖1 引起葡萄枝孢果腐病的兩種菌株的形態特征Fig.1 Morphological characteristics of two cladosporium strains causing grape fruits rot

第二類:只有1個C10菌株,在PDA培養基上生長較慢,14 d后菌落直徑為(32.4±5.5)mm。初期菌落正面為黃綠色,背面墨綠色,邊緣白色;后期菌落黃褐色,表面產生褶皺,培養基背面龜裂;菌落緊密為毛氈狀。分生孢子梗單生,有隔,大小(42.51～265.71)μm×(2.73～6.17)μm。分生孢子有隔或無隔,多鏈生或單生,一般每鏈5～7個分生孢子,最多8個分生孢子。分枝分生孢子橢圓形、長梭形,大小(7.73～23.51)μm×(2.28～5.37)μm;次級分枝分生孢子長梭形、長卵圓形,大小(4.85～15.19)μm×(2.35～4.65)μm;中間分生孢子卵圓形、檸檬形,大小(4.43～9.74)μm×(2.51～4.15)μm;末端分生孢子卵圓形、圓形,大小(3.50～8.89)μm×(1.83～3.81)μm。在掃描電鏡下,可觀察到分生孢子表面具有倒鉤狀或刺狀突起,其形態特征與檸檬形枝孢Cladosporiumlimoniforme一致(圖1：b1～b4)。

2.3.2分子生物學鑒定

真菌通用引物ITS1/ITS4擴增得到第一類菌株(C1～C9、C11～C21)片段大小為520 bp,在NCBI中BLAST比對結果顯示,與枝狀枝孢Cladosporiumcladosporioides(登錄號MH863917.1)、極細枝孢C.anthropophilum(登錄號MF472922.1)、瓜枝孢C.cucumerinum(登錄號HM148078.1)相似性分別為99.42%、98.80%、98.20%;第二類菌株(C10)擴增產物為520 bp,與檸檬形枝孢Cladosporiumlimoniforme(登錄號KT600400.1)、枝細枝孢(登錄號EF679384.1)相似性分別為99.56%、99.12%。

肌動蛋白基因引物ACT-512F/ACT-783R擴增得到第一類菌株(C1～C9、C11～C21)產物為198 bp,與枝狀枝孢(登錄號HM148516)、極細枝孢(登錄號MF473348.1)相似性分別達到98.24%、88.83%;第二類菌株(C10)擴增產物為197 bp,與檸檬形枝孢(登錄號KT600595.1)、多主枝孢C.herbarum(登錄號EF679521.1)相似性分別達到100%和84.21%。

翻譯延長因子引物TEF1-728F/TEF1-986R擴增得到第一類菌株(C1～C9、C11～C21)產物為215 bp,與枝狀枝孢(登錄號HM148244)相似性達到97.32%;第二類菌株(C10)擴增產物為210 bp,與檸檬形枝孢(登錄號KT600497.1)相似性達到97.49%。

對供試菌株進行多基因聯合系統發育分析,結果顯示第一類20個菌株,即C1～C9和C11～C21分別在兩個分支上,但均與枝狀枝孢聚在一起;第二類菌株C10與檸檬形枝孢聚在一起,形成一個分支;外群菌株甜菜生尾孢Cercosporabeticola與枝孢屬真菌分為兩個分支(圖2)。

圖2 基于 rDNA-ITS、TEF1-α、ACT 聯合序列的葡萄枝孢果腐病病原菌及相似種的系統發育分析Fig.2 Phylogenetic tree analysis of cladosporium strains causing grape fruits rot and closely related species based on concatenated sequences of rDNA-ITS， TEF1-α， ACT

根據病原菌的形態特征及多基因聯合系統發育分析,確定分離到的菌株均為枝孢屬Cladosporium,有2個種,分別是枝狀枝孢和檸檬形枝孢,其中枝狀枝孢占供試菌株的95.2%,為優勢種。

2.4 致病性測定

根據形態學和分子生物學鑒定結果選擇代表菌株C4和C10進行致病性測定。無傷接種,孢子懸浮液噴霧接種和菌絲球接種均不發病。采用有傷(針刺)接種,用孢子懸浮液和菌絲球接種均可使葡萄果實發病,一開始在傷口處出現淡色小點,后斑點逐漸擴大并出現橄欖綠色霉層。菌絲球接種(圖3f,g)比孢子懸浮液接種(圖3d,e)發病更快,癥狀也更為明顯;接種癥狀與田間發病癥狀一致(圖3a)。從接種發病后的病斑處再分離病原菌,分離到與接種所用菌株相同的菌株。

圖3 兩種枝孢菌接種成熟葡萄后引起的癥狀與成熟期自然發病癥狀Fig.3 Symptoms on mature grapes after inoculation with two Cladosporium species and natural symptoms at mature stage

2.5 兩種枝孢菌的生物學特性

2.5.1溫度對兩種枝孢菌生長和產孢量的影響

結果(表3)表明,在相同溫度條件下枝狀枝孢的生長均明顯快于檸檬形枝孢;但兩種菌對溫度的反應基本一致,即在10～30℃均可生長,在5℃和35℃時生長極為緩慢,培養14 d菌落直徑不足5 mm(接到培養基上的菌絲球直徑為2 mm)。其最適生長溫度為25℃,在25℃培養14 d,兩種枝孢菌的菌落直徑可分別達到(52.2±0.1) mm和(31.7±0.1) mm。

表3 溫度對兩種枝孢菌菌落生長和產孢量的影響1)Table 3 Effects of temperature on colony growth and sporulation capacity of two Cladosporium species

溫度對兩種菌產孢量的影響與對菌落生長的影響基本相同,均以25℃下產孢量最大,枝狀枝孢產孢量(7.38±0.11)×103個/mm2,檸檬形枝孢產孢量(6.14±0.13)×103個/mm2;其次為20℃和15℃,再次為30℃,10℃產孢量明顯減少,5℃和35℃時由于菌落基本不生長對產孢量未進行統計。

2.5.2光照對兩種枝孢菌生長和產孢量的影響

3種光照條件下都表現為枝狀枝孢的生長速度比檸檬形枝孢快，但枝狀枝孢的生長對光照不敏感,在不同光照條件下,其生長均沒有明顯差異;而檸檬形枝孢在不同光暗條件下生長有差異,以完全光照條件下生長最好。光照對枝狀枝孢的產孢量影響不大,但檸檬形枝孢在完全黑暗條件下產孢量較多(表4)。

表4 光照對兩種枝孢菌菌落生長和產孢量的影響Table 4 Effects of illuminations on colony growth and sporulation capacity of two Cladosporium species

2.5.3pH對兩種供試枝孢菌生長和產孢量的影響

結果(表5)表明,兩種枝孢菌在pH 4～10條件下均能生長和產孢。枝狀枝孢適宜生長和產孢的pH為5～7(偏酸性環境),在pH為5～7時,培養14 d菌落直徑可達到(53.0±0.1)mm,當pH=6時,產孢量最大,為(6.46±0.23)×103個/mm2。檸檬形枝孢在pH=7時生長最快,產孢量最大。培養14 d菌落直徑可達到(35.8±0.1)mm,產孢量為(4.88±0.21)×103個/mm2。

表5 pH對兩種枝孢菌菌落生長和產孢量的影響Table 5 Effects of pH on colony growth and sporulation capacity of two Cladosporium species

2.5.4兩種枝孢菌的致死溫度

將枝狀枝孢孢子懸浮液在52℃水浴鍋加熱10 min后,孢子不再萌發,確定孢子致死溫度為52℃;將裝有枝狀枝孢菌餅的離心管60℃水浴鍋加熱10 min后,菌絲不再生長,確定菌絲致死溫度為60℃。

將檸檬形枝孢孢子懸浮液在50℃水浴鍋加熱10 min后,孢子不再萌發,確定孢子致死溫度為50℃;將裝有檸檬形枝孢菌餅的離心管58℃水浴鍋加熱10 min后,菌絲不再生長,確定菌絲致死溫度為58℃。

3 結論與討論

2019年9月在新疆石河子地區葡萄果實上發現一種新的果實病害,只在成熟的果實上發現,發病較重。為此2020年8、9月間在葡萄成熟期,對南北疆一些葡萄園進行了普查,發現該病發生比較普遍,但主要在有傷口的成熟果實上出現。該病與Briceo等所報道的智利葡萄枝孢果腐病的發生時期完全一致[5],都是在果實成熟期發生,其優勢菌種也相同,都是枝狀枝孢,但沒分離到多主枝孢,而分離到檸檬形枝孢。我們從葡萄果實上分離的枝孢菌形態與焦瑞蓮等報道的3種棉鈴枝孢菌中的兩個種[9],即枝狀枝孢和檸檬形枝孢一致,只是分生孢子的大小有差異,可能與其寄主植物不同有關。值得關注的是,2017年枝孢菌引起的棉鈴病害在新疆大發生,而2019年又開始發現葡萄枝孢果腐病,它們之間的關系如何？有待進一步查明。

以形態學鑒定為基礎,經分子生物學鑒定和致病性測定,明確了引起新疆葡萄枝孢果腐病的病原有兩種,即枝狀枝孢C.cladosporioides和檸檬形枝孢C.limoniforme,其中前者占95.2%,后者只占4.8%,枝狀枝孢為優勢種。據形態觀察,枝狀枝孢和檸檬形枝孢具有枝孢屬共有的明顯特征冠狀孢痕,在枝狀枝孢分生孢子表面有不規則網紋,檸檬形枝孢分生孢子表面有明顯的倒鉤狀或刺狀突起,這些特點與Bensch等[14]及焦瑞蓮等[9]所描述的分生孢子形態基本一致。

兩種枝孢菌的生物學特性研究表明,在相同條件下枝狀枝孢的生長速度明顯比檸檬形枝孢要快。兩者之間相同之處是:它們的適宜生長和產孢溫度均為25℃,不同光暗條件下都可產生大量分生孢子。不同處是:光照對枝狀枝孢菌落生長的影響不大,但檸檬形枝孢在光照條件下生長較快,在完全黑暗條件下生長最慢。枝狀枝孢的適宜生長pH為5～7,檸檬形枝孢適宜生長pH為7。另外兩者的致死溫度也不同,前者菌絲和分生孢子的致死溫度分別為60℃和52℃,后者為58℃和50℃。

接種試驗表明,這兩種菌都是弱寄生菌,只能從傷口侵入。這和田間調查時,一般害蟲為害較重的果園或受到人工及自然傷害的果園病害發生較重的情況是一致的。因此,在葡萄生長發育過程中,采取各種措施減少鳥類蟲害和修枝疏果及雨水淋濕等造成的傷口,對預防和控制葡萄枝孢果腐病的發生可能具有重要作用。本研究結果明確了新疆葡萄枝孢果腐病病原菌及其生物學特性,為今后該病害的預測預報、發生規律和防治方法的研究打下基礎。