福州市動物園野生鳥類與周邊活禽市場禽類H9 亞型低致病性禽流感病毒感染的監測與分析

那 洋 福州市動物園 福州 350012

依據禽流感病毒的致病性， 可分為低致病性禽流感病毒（LP-AIV）和高致病性禽流感病毒（HPAIV）。 低致病性禽流感通常不引起家禽大批量死亡，癥候群一般為輕微的呼吸道癥狀或產蛋率下降，精神食欲不佳等[1]，但感染后常常引發免疫力下降，伴隨繼發、并發感染，這時病死率最高可達97%。 因此，低致病性禽流感對養殖業的危害不容忽視[2-3]。通過對高致病性禽流感流行病學的調查顯示， 大多數傳染源都來自野鳥或者水禽[3-4]。

PCR 檢測原理：將由病毒RNA 反轉的cDNA 作為模板，并設計出模板上的一段保守蛋白作為引物，DNA 在PCR 儀中呈指數增加。 若在后續電泳中出現引物的相應擴增條帶，則為陽性。 多重PCR 技術的問世解決了禽流感多種亞型以及共感染鑒別檢測復雜性的問題[5]。 多重PCR 是指在反應系統中加入多個引物， 可同時擴增出相應的核酸片段。 我國學者在前人研究基礎上建立了禽流感病毒HA 與M基因的多重PCR 技術，可檢測出目前已知的所有禽流感亞型，其靈敏性可檢測低至1 ng 的RNA 水平[6-8]。

本試驗對福州市動物園野生鳥類以及周邊部分活禽市場禽糞便棉拭子取樣， 進行H9N2 亞型禽流感病毒檢測。 福州市位于低緯度沿海地區， 屬于亞熱帶海洋性季風氣候， 是大量鳥類遷徙路線的中轉站，福州市動物園禽類種類繁多，常有救濟站或遷徙途中受傷候鳥收養于園中；福州市區內人口基數大，畜禽混養，活禽市場眾多，消費者與活禽接觸密切。之前， 沒有針對福州市動物園禽類低致病性禽流感病毒感染情況進行調查并將結果與周邊活禽市場禽類檢測情況進行對比。 本試驗結果有助于動物園進行禽流感早期檢測預防、 追蹤低致病性禽流感的傳染源及影響因素， 有助于動物園制定完善的防控措施。

1 禽流感樣本采集

于2016 年10 月至11 月共計采樣361 份，均為糞便棉拭子樣品。 其中動物園采樣共155 份， 包括9 目13 科23 種，具體種屬及樣本數量見表1；活禽市場采樣206 份，主要為雁形目（Anseriformes）與雞形目（Galliformes），包括77 份家鴨樣品、98 份家雞樣品、31 份肉用雁鵝樣品。

2 禽流感病毒M 基因RT-PCR 檢測結果與病毒亞型鑒定

運用RT-PCR 對361 份糞便棉拭子進行檢測，發現8 目127 羽份禽類攜帶禽流感病毒， 平均感染率為35.18%，動物園采樣中鴿形目的病毒感染率最高（53.33%），其次為雞形目（49.35%）。 活禽市場采樣中雀形目的感染率最高（46.75%），其次為雞形目（29.17%）。動物園中檢出4 例H9N2 陽性，活禽市場所采樣中暫未發現H9N2 亞型陽性。 各特異性引物RT-PCR 電泳結果見圖1。

表1 動物園采樣種屬及數量

圖1 各特異性引物陽性及陰性對照PCR 電泳圖

將動物園采集的樣品進行RT-PCR 檢測，M 基因與H9 以及N2 亞型同時出現陽性條帶， 判定為H9N2 亞型禽流感陽性，見圖2。

將活禽市場采集的樣品進行RT-PCR 檢測，M基因與其他亞型同時出現陽性條帶， 判定為相應亞型禽流感陽性，見圖3。

圖2 動物園采樣RT-PCR 示例圖

圖3 活禽市場采樣RT-PCR 示例圖

病毒M 基因陽性鳥種與陽性率，見表2。

3 討 論

表2 病毒M 基因陽性鳥種與陽性率

3.1 福州市動物園禽類AIV 傳播趨勢情況分析本研究主要針對動物園野生鳥類及周邊活禽市場禽類低致病性禽流感病毒代表亞型H9N2 的感染情況進行調查。 共檢測361 份糞便拭子，均為2016 年秋季取樣。 采樣種類較多、總體數量較少，但其結果基本能代表市區動物園野生鳥類和周邊活禽市場禽類禽流感病毒感染情況。

目前所得128 例M 基因陽性樣本中，動物園有4 例H9N2 亞型， 其中3 例為雞形目； 活禽市場0例。 動物園與活禽市場最高兩目禽的感染率對比見圖4。 推測原因為野生雉雞的生活及覓食習性與動物園飼養環境相近， 導致低致病性禽流感病毒更易攜帶、傳播；周邊活禽市場的家禽主要來自規模化養殖場，攜帶病毒的可能性較小。

圖4 禽類感染率最高及次高柱形比較圖

3.2 本地區動物園禽流感傳播風險與防控措施從流行病學檢測結果分析， 本地區動物園內禽流感陽性率高于同種類全球平均陽性率。 據以往病例分析，近年來未發現動物園內禽類禽流感死亡病例，但偶發性出現低致病性禽流感相應臨床癥狀， 與本次調查結果相符。 低致病性禽流感雖較少引起大批量死亡現象，但容易與其他病原共感染。

現有調查數據顯示， 周邊活禽市場禽的低致病性禽流感感染率小于動物園內現有的禽類， 因此推測動物園的主要傳染源有可能來自遷徙候鳥、 救助站救助的野生禽類。 建議對動物園內現有禽類進行遷徙候鳥保護措施，密切檢測“非法入境者”，對被救助禽類進行全面隔離和檢測[9-10]。

鑒于此次調查范圍較小，也未對RT-PCR 結果進行測序， 不能完全推測該地區禽流感病毒感染情況、流行株基因遺傳特征及流行演變趨勢。擬進行后續研究， 將測序結果在NCBI 數據庫Genbank 進行同源性比對，不同時間、季節采樣，擴大采樣數量，深入進行流行病學調查。將園內現有野生禽類保護好，真正做到防患于未然， 發揮流行病學監測的預防與預警作用。