苦參堿調節AMPK/SIRT3信號通路對高脂飲食誘導肥胖癥大鼠心功能的影響Δ

盛蓉輝，張 松，王麗娟

(1.西安市兒童醫院心內科，西安 710003； 2.空軍第九八六醫院藥劑科，西安710032； 3.西安市兒童醫院感染科，西安 710003)

近年來，隨著人們生活水平的提高以及生活方式的改變，肥胖癥的發病率逐年升高，已經成為全球性的公共健康問題[1]。肥胖癥也是多種心腦血管疾病，如高血壓、高脂血癥、糖尿病、腫瘤和動脈粥樣硬化等發生發展的重要危險因素[2-3]。因此，尋找治療與預防肥胖癥的有效手段，對于降低各種心腦血管疾病發生率具有關鍵意義。研究結果表明，常規藥物、手術，以及控制飲食、加強運動等手段治療肥胖癥都存在一些不良反應，且極易復發[4]。中藥已被證實在防治肥胖癥方面具有明顯的效果[5]。因此，尋找更多、更有效的中藥治療肥胖癥已成為必然趨勢。苦參堿為中藥苦參的主要活性成分，具有抗炎、抗菌以及抗腫瘤等作用[6-7]，現已被廣泛用于肥胖癥、糖尿病等相關疾病的治療[8]。但苦參堿對于肥胖癥大鼠心功能的影響尚無研究報道。研究結果發現，膿毒性心肌病中沉默信息調節因子2相關酶3(SIRT3)過表達以及AMP活化蛋白激酶(AMPK)通路激活會促進線粒體內生物合成，從而改善心肌細胞死亡[9]。在氧化應激相關的慢性心肌損傷中，AMPK和SIRT3下調是導致心肌細胞損傷的主要分子機制[10]。本研究通過高脂飲食誘導建立肥胖癥大鼠模型，探討苦參堿能否通過調控AMPK/SIRT3信號通路，發揮對肥胖癥大鼠心功能的保護作用。

1 材料

1.1 實驗動物

6周齡SPF級SD雄性大鼠，體重為(200±20) g，購自中國醫學科學院醫學實驗動物研究所，許可證號為SCXK(京)2018-0002。實驗動物適應性飼養1周，期間自由飲水采食，溫度控制在(22±2) ℃，相對濕度為(55±5)%，晝夜周期為1∶ 1。

1.2 儀器

TY-6868A-1型超聲診斷儀(上海聚慕醫療器械有限公司)；邁瑞BC-30Vet型獸用全自動血液細胞分析儀(北京賽百奧科技有限公司)；Azure Biosystems C150型凝膠成像系統[普邁精醫科技(北京)有限公司]。

1.3 藥品與試劑

普通飼料、高脂飼料(北京華阜康生物科技有限公司，批號為1024、H10060)；苦參堿(成都植標化純生物技術有限公司，批號為PCS0572)；二甲雙胍(中美上海施貴寶制藥有限公司，規格為0.5 g/片，批準文號為國藥準字H20023370)；AF488標記的麥胚凝集素(WGA，美國AAT Bioquest公司，批號為25500)；兔抗大鼠一抗p-AMPK、AMPK、SIRT3、GAPDH、HRP標記的羊抗兔二抗(ab6721)(英國Abcam公司，批號為ab133448、ab207442、ab246522、ab8245、ab6721)。

2 方法

2.1 建模與分組

將若干SD大鼠分為兩組，其中10只大鼠給予普通飼料作為空白組，其余大鼠給予高脂飼料建立高脂飲食誘導肥胖癥大鼠模型，每周稱取1次體重。飼喂2周后，淘汰體重增加較少的大鼠，挑選出50只大鼠繼續給予高脂飼料6周，空白組大鼠依然給予普通飼料。造模結束后，將50只模型大鼠隨機分為五組，即模型組，二甲雙胍組(20 mg/kg)，苦參堿低(7.5 mg/kg)、中(15 mg/kg)和高(30 mg/kg)劑量組，每組10只[11]。連續給藥6周，期間空白組大鼠給予普通飼料，其余五組大鼠給予高脂飼料。開始給藥時(給藥開始)與實驗結束后(給藥結束)各稱取1次體重。

2.2 大鼠心功能測定

麻醉大鼠后，左側臥位固定，胸部剪毛后涂抹耦合劑，運用超聲診斷儀，選取左心室長軸與乳頭肌水平短軸切面，檢測并記錄各組大鼠左心室收縮末期內徑(LVESD)、左心室舒張末期內徑(LVEDD)、左心室射血分數(LVEF)、左心室短軸縮短率(LVFS)、左心室舒張末期容積(LVEDV)和左心室收縮末期容積(LVESV)。每只大鼠各取3個完整心動周期的平均數值作為最終檢測結果。

2.3 大鼠靜脈血中血糖、胰島素水平檢測

實驗結束前禁食12 h，取靜脈血，采用全自動分析儀測定各組大鼠空腹血糖(FBG)、空腹胰島素(FINS)水平。

2.4 心肌組織WGA染色

處死大鼠，分離左心室心肌組織，以PBS沖洗干凈后用4%多聚甲醛固定，梯度酒精脫水后石蠟包埋、切片。將切片采用常規方法脫蠟水合，滴加胰酶工作液孵育后以PBS漂洗，加入WGA工作液，避光溫箱孵育2 h，以PBS清洗，加入封固劑封片，于光學顯微鏡400倍下觀察拍照。通過Image-Pro Plus 8.0軟件選取合適視野，測量視野內心肌組織面積及細胞核總數，得出單個心肌細胞表面積。單個心肌細胞表面積(mm2)=組織面積(mm2)/細胞核總數。

2.5 蛋白質印跡法檢測心肌組織AMPK/SIRT3相關蛋白表達水平

處死大鼠，分離左心室心肌組織，加入蛋白裂解液勻漿后，再采用BCA蛋白濃度檢測試劑盒測定總蛋白濃度，上樣進行電泳、轉膜，4%脫脂牛奶封閉2 h，清洗后加入兔抗大鼠一抗p-AMPK、AMPK、SIRT3和GAPDH，4 ℃下孵育過夜，清洗后再加入HRP標記的羊抗兔二抗室溫(25 ℃)下孵育2 h，清洗后采用ECL顯色試劑盒進行顯色操作，通過凝膠成像系統收集圖像，進行灰度值分析。

2.6 統計學方法

3 結果

3.1 六組大鼠體重變化比較

給藥開始前，與空白組比較，模型組、二甲雙胍組和苦參堿各劑量組大鼠體重均顯著增加，差異均有統計學意義(P<0.05)。給藥結束后，與空白組比較，模型組大鼠體重顯著增加；與模型組比較，二甲雙胍組和苦參堿各劑量組大鼠體重明顯降低；與二甲雙胍組比較，苦參堿低、中劑量組大鼠體重明顯增加，上述差異均有統計學意義(P<0.05)；與二甲雙胍組比較，苦參堿高劑量組大鼠體重有增加趨勢，但差異無統計學意義(P>0.05)；苦參堿各劑量組大鼠體重的變化具有劑量效應，差異有統計學意義(P<0.05)，見表1。

表1 六組大鼠體重比較Tab 1 Comparison of body weights among six groups

3.2 六組大鼠心功能變化比較

與空白組比較，模型組大鼠的LVESD、LVEDD、LVEDV和LVESV水平明顯升高，LVEF、LVFS水平明顯降低，差異均有統計學意義(P<0.05)；與模型組比較，二甲雙胍組和苦參堿各劑量組大鼠的LVESD、LVEDD、LVEDV和LVESV水平明顯降低，LVEF、LVFS水平明顯升高，差異均有統計學意義(P<0.05)；苦參堿各劑量組大鼠上述指標的變化具有劑量效應，差異有統計學意義(P<0.05)；苦參堿高劑量組與二甲雙胍組大鼠上述指標比較，差異均無統計學意義(P>0.05)，見表2—3。

表2 六組大鼠LVESD、LVEDD、LVEDV和LVESV水平比較Tab 2 Comparison of LVESD, LVEDD, LVEDV and LVESV among six groups of rats

表3 六組大鼠LVEF、LVFS水平比較Tab 3 Comparison of LVEF and LVFS among six groups

3.3 六組大鼠靜脈血中血糖、胰島素水平比較

與空白組比較，模型組大鼠FBG、FINS水平明顯升高；與模型組比較，二甲雙胍組和苦參堿各劑量組大鼠FBG、FINS水平明顯降低；與二甲雙胍組比較，苦參堿低、中劑量組大鼠FBG、FINS水平明顯升高，上述差異均有統計學意義(P<0.05)，見表4。苦參堿高劑量組大鼠上述指標水平較二甲雙胍組有升高趨勢，但差異無統計學意義(P>0.05)；苦參堿各劑量組大鼠上述指標的變化具有劑量效應，差異有統計學意義(P<0.05)，見表4。

表4 六組大鼠FBG、FINS水平比較Tab 4 Comparison of FBG and FINS levels among six

3.4 六組大鼠左心室心肌細胞表面積變化比較

WGA染色結果顯示，與空白組比較，模型組大鼠心肌細胞表面積明顯增加；與模型組比較，二甲雙胍組和苦參堿各劑量組大鼠心肌細胞表面積明顯降低；與二甲雙胍組比較，苦參堿低、中劑量組大鼠心肌細胞表面積明顯增加，上述差異均有統計學意義(P<0.05)，見圖1、表5。苦參堿高劑量組與二甲雙胍組大鼠心肌細胞表面積比較，差異無統計學意義(P>0.05)；苦參堿各劑量組間大鼠心肌細胞表面積的變化具有劑量效應，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖1、表5。

A.空白組；B.模型組；C.二甲雙胍組；D.苦參堿低劑量組；E.苦參堿中劑量組；F.苦參堿高劑量組A.blank group; B.model group; C.metformin group; D.low-dose matrine group; E. medium-dose matrine group; F. high-dose matrine group圖1 六組大鼠左心室心肌細胞表面積的變化(WGA, ×400)Fig 1 Changes of the surface area of myocardial cells in left ventricle in six groups of rats (WGA, ×400)

表5 六組大鼠左心室心肌細胞表面積比較Tab 5 Comparison of the surface area of myocardial cells in left ventricle among six groups of rats

3.5 六組大鼠心肌組織中p-AMPK、AMPK、SIRT3蛋白表達水平比較

與空白組比較，模型組大鼠心肌組織中p-AMPK/AMPK、SIRT3蛋白表達水平明顯降低；與模型組比較，二甲雙胍組和苦參堿各劑量組大鼠心肌組織中p-AMPK/AMPK、SIRT3蛋白表達水平明顯升高；與二甲雙胍組比較，苦參堿低、中劑量組大鼠心肌組織中p-AMPK/AMPK、SIRT3蛋白表達水平明顯降低，上述差異均有統計學意義(P<0.05)，見圖2、表6。苦參堿高劑量組上述蛋白表達水平與二甲雙胍組比較有降低趨勢，但差異無統計學意義(P>0.05)；苦參堿各劑量組大鼠心肌組織中p-AMPK/AMPK、SIRT3蛋白表達的變化具有劑量效應，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖2、表6。

A.空白組；B.模型組；C.二甲雙胍組；D.苦參堿低劑量組；E.苦參堿中劑量組；F.苦參堿高劑量組A.blank group; B.model group; C.metformin group; D.low-dose matrine group; E.medium-dose matrine group; F.high-dose matrine group圖2 六組大鼠心肌組織中p-AMPK、AMPK和SIRT3蛋白表達水平Fig 2 Expression of p-AMPK, AMPK and SIRT3 protein in myocardial tissues in six groups of rats

表6 六組大鼠心肌組織中p-AMPK/AMPK、SIRT3蛋白表達水平比較Tab 6 Comparison of p-AMPK/AMPK and SIRT3 protein expression in myocardial tissues among six groups

4 討論

肥胖癥為慢性代謝紊亂疾病，其發病率升高是多種心腦血管疾病發病風險升高的重要因素。肥胖癥可引起血脂、血糖代謝異常以及胰島素抵抗，導致心功能改變和心肌細胞肥大[12]。但其機制較為復雜。本研究通過高脂飲食誘導建立肥胖癥大鼠模型，結果發現，模型組大鼠體重增加，FBG、FINS水平升高，提示大鼠體內發生血糖代謝紊亂以及胰島素抵抗；模型組大鼠心功能指標LVESD、LVEDD、LVEDV和LVESV水平明顯升高，LVEF、LVFS水平明顯降低，提示模型組大鼠左心室心肌組織增厚，舒張功能發生障礙，心功能出現代償性增強。通過WGA染色結果進一步驗證，模型組大鼠心肌細胞表面積增加，提示心肌組織增厚，導致心功能改變、心室舒張功能障礙。

苦參堿可以改善肥胖癥和糖尿病，目前已被廣泛用于乙型肝炎以及多種心血管疾病的臨床治療[13-14]。本研究結果表明，與模型組比較，苦參堿干預后的高脂飲食誘導肥胖癥大鼠體重降低，FBG、FINS水平降低，提示苦參堿可以逆轉大鼠體內的血糖代謝紊亂和胰島素抵抗；LVESD、LVEDD、LVEDV和LVESV水平降低，LVEF、LVFS水平升高，提示苦參堿可有效減輕左心室心肌組織增厚，提高心肌舒張功能，保護心功能。二甲雙胍是目前臨床治療糖尿病的一線藥物，本實驗中其作為苦參堿的陽性對照，證實了苦參堿對高脂飲食誘導肥胖癥大鼠的糖代謝紊亂有顯著調節作用。

SIRT3是高度保守的、依賴于NAD+的線粒體蛋白，在機體中通過去乙酰化修飾蛋白，涉及多個細胞過程[15]。研究結果發現，SIRT3可以通過調節線粒體功能，調控心臟的能量代謝，對心功能起到保護作用[16]。有研究結果證實，紅景天苷能夠通過激活線粒體生物發生、AMPK的磷酸化以及SIRT3來保護糖尿病心肌病小鼠的心臟功能[17]。AMPK是細胞中的能量傳感器，在機體中參與調節能量代謝，越來越多的研究結果證實，AMPK調節線粒體生物學，具有維持代謝和內環境穩態的作用[18]。SIRT3是AMPK下游的關鍵調控因子，研究結果表明，藥物干預激活AMPK/SIRT3信號通路可以明顯改善由氧化應激介導的心血管疾病，且可以有效逆轉脂多糖引起的心肌收縮舒張功能降低，減輕心肌肥厚以及抑制心肌纖維化，起到對心臟的保護作用[19-21]。苦參堿可保護心肌細胞免受缺血/再灌注損傷，通過激活心肌細胞中的AMPK/SIRT3通路來減輕缺氧/復氧誘導的心肌細胞死亡[22]。本研究結果顯示，與模型組比較，苦參堿各劑量組大鼠心肌組織中p-AMPK、AMPK和SIRT3蛋白表達水平升高，說明苦參堿能夠通過激活AMPK/SIRT3通路而抵抗心肌組織肥厚以及舒張功能障礙，保護高脂飲食誘導的肥胖癥大鼠的心功能。

綜上所述，苦參堿可減輕高脂飲食誘導的肥胖癥大鼠左心室心肌組織增厚，提高心肌舒張功能，保護心功能，可能與AMPK/SIRT3通路的激活有關，但其具體機制還需結合臨床研究進一步驗證。