維生素D通過調控磷脂酰肌醇3激酶信號通路對妊娠糖尿病小鼠糖脂代謝的影響及機制研究Δ

崔麗娟，薛 潔，彭志美

(邯鄲市第一醫院產科，河北 邯鄲 056000)

妊娠糖尿病(gestational diabetes mellitus，GDM)是妊娠期間由胰島素分泌紊亂或胰島素功能障礙引起的，為妊娠期常見并發癥[1]。據報道，我國2013年GDM的發病率在5%～10%[2]。隨著社會經濟的發展及生活水平的提高，GDM發病率逐年升高，增加了妊娠及生產風險，給母嬰健康造成嚴重危害，及時干預治療對于母體及胎兒具有重要意義。維生素D屬于類固醇激素，一般由皮膚中的7-脫氫膽固醇經紫外線照射合成，病理性缺乏時則通過藥物補給[3]。維生素D可以保護胰島β細胞，促進肝糖原合成；維生素D缺乏會導致糖代謝異常，引起血糖水平升高，增加糖尿病發生風險[4-5]。但維生素D在體內的作用機制尚不明確。研究結果表明，磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)信號通路為胰島素轉錄的重要途徑，其信號分子的異常可能參與GDM的發生和發展[6]。本研究通過于妊娠期小鼠腹腔注射鏈脲佐菌素(STZ)構建小鼠GDM模型，觀察維生素D對GDM小鼠糖脂代謝的作用，并通過PI3K信號通路闡述維生素D調節糖脂代謝的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物：SPF級雌性昆明小鼠80只，雄性昆明小鼠40只，體質量18～20 g，購自杭州子源實驗動物科技有限公司，許可證號為SCXK(浙)2019-0004。所有小鼠適應性喂養1周，濕度為(50±5)%，溫度為(22±3)℃，自由飲食進水。測定小鼠空腹12 h血糖，均≤6.1 mmol/L。

1.1.2 儀器：CM1520型冷凍切片機、DM500型顯微鏡(日本Leica公司)；TRUE MTRIX型血糖儀(湖南三諾生物傳感股份有限公司)；D10型糖化血紅蛋白檢測儀(美國Bio-Rad公司)；iMark型酶標儀(美國Bio-Rad公司)；Nanodrop2000型超微量紫外分光光度計(美國Thermo公司)；ABI7500型熒光定量PCR儀(美國ABI公司)；CheniDoc XRS+型化學發光成像儀(美國Bio-Rad公司)；HE-120型水平電泳、VE-180型垂直電泳(上海天能科技有限公司)。

1.1.3 藥品與試劑：維生素D滴劑[國藥控股星鯊制藥(廈門)有限公司，批準文號為國藥準字H35021450，批號為12923002，規格為400 IU/粒(國際標準：1 IU維生素D=0.025 μg維生素D3)]；檸檬酸鈉、STZ(美國Sigma公司，貨號為S0130)；激動劑(茴香霉素，德國Merck公司，貨號為A5862，規格為10 mg/支)；三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)及總膽固醇(TC)試劑盒(南京建成生物工程研究所，貨號為A110-1-1、A113-1-1及A111-1-1)；空腹胰島素(FINS)試劑盒(上海研吉生物科技有限公司，貨號為BS-E7687H1)；蘇木精-伊紅染色(HE染色)試劑盒(北京索萊寶科技有限公司，貨號為G1120)；兔抗鼠PI3K、葡萄糖轉運蛋白4(GLUT-4)、蛋白激酶B(AKT)和小鼠抗大鼠GAPDH抗體(美國Abcam公司，貨號為ab283852、ab33780、ab38449和ab8245)；蛋白Marker[寶日醫生物技術(北京)有限公司]；2×SYBR Green熒光染料(美國Roche公司)；反轉錄試劑盒、二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量試劑盒和ECL顯影液(美國Bio-Rad公司，貨號為12004856、5000114和1705062)。

1.2 方法

1.2.1 妊娠期小鼠的篩選及分組：雌性與雄性小鼠2∶ 1合籠飼養，每日清晨進行雌鼠陰道檢查，以陰栓和精子為受孕標記，記為妊娠第1日。將75只妊娠期昆明小鼠，隨機分為五組，即對照組、GDM組、維生素D低劑量組、維生素D高劑量組和激動劑組，每組15只。

1.2.2 模型制備：確定妊娠后第1日，GDM組、維生素D低劑量組、維生素D高劑量組和激動劑組小鼠連續3 d腹腔注射50 mg/kg STZ(STZ溶于0.1 mol/L檸檬酸緩沖液，配制STZ原液20 mg/mL，pH為4.4±0.3)，1日1次，最后1次注射后空腹12 h，測定空腹血糖(FBG)≥11.1 mmol/L為造模成功[7]。GDM組12只、維生素D低劑量組13只、維生素D高劑量組14只和激動劑組12只小鼠造模成功。對照組小鼠每日腹腔注射等量檸檬酸緩沖液。妊娠期間，對照組小鼠飼喂普通飼料維持飼養，其余組小鼠飼喂高糖高脂飼料。

1.2.3 干預方法：從妊娠第8日開始，對照組、GDM組小鼠每日灌胃花生油0.05 mL，維生素D低劑量組、維生素D高劑量組小鼠每日分別灌胃維生素D(溶于0.05 mL花生油)0.05、0.20 μg/kg，至妊娠第19日結束。激動劑組小鼠從第8日開始，每日灌胃維生素D(溶于0.05 mL花生油)0.20 μg/kg+腹腔注射茴香霉素2 mg/kg，至妊娠第19日結束。

1.2.4 組織收集：妊娠第19日給藥結束后2 h處死小鼠，每只取血2.5 mL，4 ℃下靜置1 h，以4 500 r/min離心(離心半徑為13.5 cm)10 min，置于-20 ℃保存備用。取部分肝組織以0.9%氯化鈉溶液清洗后，用甲醛固定，用于HE染色；部分置于-80 ℃保存，用于基因及蛋白提取，后續通過實時熒光定量PCR(RT-qPCR)及蛋白質印跡法檢測。

1.2.5 血糖化血紅蛋白(HbA1c)、FBG、FINS、TC、TG和LDL-C水平測定：采用血糖儀測定FBG水平，采用糖化血紅蛋白儀測定HbA1c水平。取-20 ℃凍存血清，通過酶聯免疫吸附試驗測定FINS、TC、TG和LDL-C水平，按照試劑盒說明操作，測定光密度(OD)，根據標準曲線，計算各指標含量。

1.2.6 肝臟病理學檢查：采用多聚甲醛固定肝組織后通過乙醇脫水，石蠟包埋，切片厚度為5 μm，60 ℃烘干，HE染色，待二甲苯徹底脫水透明后以中性樹膠封蓋，于顯微鏡下觀察肝細胞損傷情況。

1.2.7 PI3K、AKT和GLUT-4 mRNA相對表達量檢測：用液氮凍存小鼠肝臟組織，勻漿提取RNA并測定含量，逆轉錄合成cDNA，-20 ℃穩定保存，反應體系為RNAase free水 8 μL，dT18 1.5 μL，RNA 5.5 μL。RT-qPCR反應體系為上下游引物(濃度10 μmol/L)各1 μL，cDNA 3 μL，預混液(Ex Taq)12 μL，ddH2O 8 μL。反應程序為98 ℃，10 min；95 ℃，45 s；59 ℃，30 s；72 ℃，60 s；共45個循環。以GAPDH為內參，記錄反應CT值，計算PI3K、AKT和GLUT-4 mRNA相對表達量(2-△△CT法)，上下游引物序列見表1。

1.2.8 PI3K、AKT、p-AKT和GLUT-4蛋白相對表達量檢測：取肝組織80 mg，以液氮研磨后加入RIPA裂解液1 mL，4 ℃、12 000 r/min下離心(離心半徑為13.5 cm)15 min，通過BCA法測定蛋白含量。通過十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰氨凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白，上層濃縮膠，下層分離膠，蛋白樣品與上樣緩沖液混合后，使用移液槍加入上樣孔，120 V濃縮膠電泳，200 V分離膠電泳至結束。取甲醇活化后的PVDF膜濕轉印100 V、60 min，封閉PVDF膜2.5 h后加入已稀釋一抗(1∶ 5 000)，4 ℃過夜，次日加入稀釋二抗(1∶ 2 500)，常溫孵育2 h，TBST沖洗后加入ECL孵育5 min，曝光成像，對比PI3K、AKT、p-AKT和GLUT-4與GAPDH灰度值計算蛋白表達情況。

1.3 統計學方法

2 結果

2.1 五組小鼠糖代謝指標FBG、HbA1c和FINS水平比較

與對照組比較，GDM組小鼠FBG、HbA1c和FINS水平均升高，差異均有統計學意義(P<0.05)；與GDM組比較，維生素D低劑量組、維生素D高劑量組及激動劑組小鼠FBG、HbA1c和FINS水平均降低，其中維生素D高劑量組低于維生素D低劑量組和激動劑組，差異均有統計學意義(P<0.05)；維生素D低劑量組與激動劑組小鼠FBG、HbA1c和FINS水平的差異均無統計學意義(P>0.05)，見表2。

表2五組小鼠糖代謝指標FBG、HbA1c和FINS水平比較Tab 2 Comparison of FBG, HbA1c and FINS among

2.2 五組小鼠脂代謝指標TC、TG和LDL-C水平比較

與對照組比較，GDM組小鼠TC、TG和LDL-C水平均升高，差異均有統計學意義(P<0.05)；與GDM組比較，維生素D低劑量組、維生素D高劑量組及激動劑組小鼠TC、TG和LDL-C水平均降低，其中維生素D高劑量組低于維生素D低劑量組和激動劑組，差異均有統計學意義(P<0.05)；維生素D低劑量組與激動劑組小鼠TC、TG和LDL-C水平的差異均無統計學意義(P>0.05)，見表3。

表3 五組小鼠脂代謝指標TC、TG和LDL-C水平比較Tab 3 Comparison of TC, TG and LDL-C among five

2.3 五組小鼠肝組織病理學染色觀察

對照組小鼠肝細胞及肝小葉結構正常；GDM組小鼠肝細胞凌亂松散，嗜酸性脂肪病變，肝索結構紊亂；維生素D低劑量組小鼠肝細胞排列稍亂，肝小葉結構少量炎細胞浸潤，未見病灶壞死；維生素D高劑量組肝細胞排列整齊，匯管區未見炎癥，少量肝細胞脂肪變性；激動劑組肝小葉結構正常，散在脂肪細胞變性，未見組織增生，見圖1。

圖1 肝組織病理學切片(HE，×100)Fig 1 Liver histopathology (HE，×100)

2.4 五組小鼠肝組織中PI3K、AKT和GLUT-4 mRNA相對表達量比較

五組小鼠肝組織中AKT mRNA相對表達量比較，差異均無統計學意義(P>0.05)。與對照組比較，GDM組小鼠肝組織中PI3K、GLUT-4 mRNA相對表達量降低，差異均有統計學意義(P<0.05)；與GDM組比較，維生素D低劑量組、維生素D高劑量組及激動劑組小鼠肝組織中PI3K、GLUT-4 mRNA相對表達量升高，其中維生素D高劑量組高于維生素D低劑量組和激動劑組，差異均有統計學意義(P<0.05)；維生素D低劑量組與激動劑組小鼠肝組織中PI3K、GLUT-4 mRNA相對表達量的差異無統計學意義(P>0.05)，見表4。

表4 五組小鼠肝組織中PI3K、AKT和GLUT-4 mRNA相對表達量比較Tab 4 Comparison of relative expression of PI3K, AKT, GLUT-4 mRNA in liver tissues among five groups

2.5 五組小鼠肝組織中PI3K、AKT、p-AKT和GLUT-4蛋白相對表達量比較

五組小鼠肝組織中AKT蛋白相對表達量比較，差異無統計學意義(P>0.05)。與對照組比較，GDM組小鼠肝組織中PI3K、p-AKT和GLUT-4蛋白相對表達量降低，差異均有統計學意義(P<0.05)；與GDM組比較，維生素D低劑量組、維生素D高劑量組及激動劑組小鼠肝組織中PI3K、p-AKT和GLUT-4蛋白相對表達量升高，其中維生素D高劑量組高于維生素D低劑量組和激動劑組，差異均有統計學意義(P<0.05)；維生素D低劑量組與激動劑組小鼠肝組織中PI3K、p-AKT和GLUT-4蛋白相對表達量的差異均無統計學意義(P>0.05)，見圖2、表5。

圖2 蛋白條帶Fig 2 Western blot protein bands

表5 五組小鼠肝組織中PI3K、AKT、p-AKT和GLUT-4蛋白相對表達量比較Tab 5Comparison of relative expression of PI3K, AKT, p-AKT,GLUT-4 protein in liver tissues among five groups

3 討論

GDM的發生可導致機體在妊娠期間出現糖代謝異常，引起先兆子癇、胎兒過大、分娩損傷甚至炎癥感染等一系列生產風險，嚴重影響妊娠期婦女及胎兒的生命安全[8-10]。PI3K通路與胰島素細胞活化、胰島素合成和血糖調節等過程息息相關[11]。維生素D的主要作用是維持鈣磷穩態和促進骨骼發育，近年來有研究結果表明，維生素D可以上調胰島素轉錄基因表達，增加胰島素分泌，促進葡萄糖轉運，抑制脂肪合成，防止脂質積累，維持機體糖脂代謝平衡，因此，維生素D缺乏可能是導致糖脂代謝紊亂的原因之一[12-14]。但維生素D在GDM中的具體作用機制仍不明確。本研究通過探討PI3K通路闡述維生素D調控糖脂代謝的作用機制，為進一步闡明維生素D參與GDM發生發展奠定基礎。

本研究結果發現，GDM組小鼠肝細胞排列雜亂，嗜酸性脂肪病變，肝索結構紊亂，肝小葉可見少量結締組織增生，提示GDM小鼠存在肝損傷。肝臟是胰島素作用的重要器官，可以合成肝糖原，降低血糖水平[15]。有研究結果顯示，STZ對胰島β細胞有高度特異毒性，可以導致胰島素分泌減少，無法維持血糖穩定，故STZ成為構建糖尿病模型的理想藥物[16]。本研究的病理結果顯示，維生素D各劑量組及激動劑組小鼠肝細胞損傷均減輕，其中維生素D高劑量組病變較輕，提示維生素D可以減輕GDM小鼠的肝損傷。與對照組比較，GDM組小鼠FBG、HbA1c、FINS、TC、TG和LDL-C水平均升高，提示GDM小鼠存在糖脂代謝紊亂；與GDM組比較，維生素D低劑量組、維生素D高劑量組上述糖脂代謝指標水平均降低，且維生素D高劑量組更低，提示維生素D可以調節GDM小鼠的糖脂代謝水平。HbA1c是血糖及血紅蛋白的代謝物，其含量是衡量血糖控制的“金標準”[17-18]。HbA1c結合FBG及FINS水平可反映糖尿病患者體內糖代謝水平。HbA1c水平紊亂可導致游離脂肪酸水平升高，多種酶活性降低，TC、TG和LDL-C水平升高，造成脂代謝紊亂。

PI3K屬于磷酸化磷脂酰肌酶家族，胰島素通過結合胰島素β受體可激活PI3K，PI3K活化后將信號傳遞至GLUT-4，進而調節下游信號分子，調整機體糖脂代謝[19-21]。本研究結果發現，與對照組比較，GDM組小鼠肝組織中PI3K、GLUT-4 mRNA和蛋白相對表達量及p-AKT蛋白相對表達量均降低；與GDM組比較，維生素D低劑量組、維生素D高劑量組小鼠肝組織中PI3K、GLUT-4 mRNA和蛋白相對表達量及p-AKT蛋白相對表達量均升高，且維生素D高劑量組最高，提示維生素D可以激活GDM小鼠肝臟中PI3K通路，激活PI3K、GLUT-4活性及AKT蛋白磷酸化水平。本研究在維生素D基礎上進一步應用PI3K激動劑干預，結果顯示，激動劑組小鼠肝組織中PI3K、GLUT-4 mRNA和蛋白相對表達量及p-AKT蛋白相對表達量低于維生素D高劑量組，且糖脂代謝指標高于維生素D高劑量組，證實維生素D的確可通過PI3K信號通路改善GDM糖脂代謝紊亂，促進機體糖脂代謝平衡，并且隨著劑量增加，可以進一步上調PI3K通路表達。

綜上所述，維生素D可能通過調控PI3K通路，改善肝細胞損傷。本研究可為維生素D在GDM中的科學應用提供依據。