趙福振，都 勇，蔣曉霞，李玉全，周傲白雪，李寒雪，諶升友，羅寶正

棘球蚴病又稱包蟲病，是一種由棘球絳蟲中絳期(metacestode)幼蟲寄生于人或動物體內而引起的一種危害嚴重的人獸共患寄生蟲病，在世界范圍內嚴重危害人體健康和畜牧業發展[1]。棘球絳蟲目前共5種，包括細粒棘球絳蟲(Echinococcusgranulosus)、多房棘球絳蟲(Echinococcusmultilocularis)、少節棘球絳蟲(Echinococcusoligarthra)、福氏棘球絳蟲(Echinococcusvogeli)和石渠棘球絳蟲(Echinococcusshiquicus)。在我國主要存在的是細粒棘球絳蟲、多房棘球絳蟲和石渠棘球絳蟲。棘球蚴病呈全球性分布，我國主要流行于西藏、四川、青海、寧夏等省(自治區)，其中屬四川省甘孜藏族自治州最為嚴重[2]。目前，我國人獸之間主要流行的囊性棘球蚴病和泡型棘球蚴病分別是由細粒棘球絳蟲和多房棘球絳蟲感染引起[3]，少有其它棘球絳蟲感染人的病例。

棘球絳蟲的終末宿主要是犬、貓、狐、狼等食肉類動物，牛、羊等有蹄類動物是常見的中間宿主[3]，人類通過誤食絳蟲蟲卵被感染后也可成為中間宿主。棘球蚴中的原頭蚴可在終末宿主小腸內發育成成蟲，并產生蟲卵。蟲卵會隨宿主糞便排出，影響周邊水源等環境，中間宿主感染后，蟲卵會在體內發育成棘球蚴，幾乎可以感染任何器官(尤其是肝臟)，導致器官發生功能障礙，嚴重的可致死亡。棘球蚴和蟲卵是棘球絳蟲的不同生長階段，遺傳物質信息保持不變。本文使用實時熒光PCR技術，根據5種棘球絳蟲的線粒體基因序列設計引物探針，建立一種對終末宿主和中間宿主快速、高效、靈敏的檢測方法以進行早期診斷，發現問題及時進行驅蟲消毒治療等工作，在一定程度上可切斷棘球絳蟲的傳染鏈條，對棘球蚴病防控環節可發揮重要作用，期望為棘球蚴病的預防和控制環節提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 樣本 犬糞便樣本84份，為中國疾病預防控制中心寄生蟲病預防控制所的測評樣本，其中陽性樣品為實驗室人工感染的陽性犬糞樣品，陰性樣品為非棘球蚴病流行區家犬糞便樣品。患病牛、羊解剖的病變組織樣本及其囊液共18份，由天之泰生物技術研究院(珠海)有限公司提供，已對病變組織解剖并觀察確診為陽性；犬弓首蛔蟲(Toxocaracanis)、多頭絳蟲(Taeniamulticeps)、豬帶絳蟲(Taeniasolium)、牛帶絳蟲(Taeniasaginata)基因組DNA各1份，為實驗室保存樣本；陽性質粒為含有目的基因的重組質粒，由上海旭冠生物科技發展有限公司合成。

1.2 主要試劑 熒光PCR反應試劑使用珠海寶銳生物科技有限公司的“Superstart Premix plus(Probe qPCR)”產品，DNA提取試劑盒使用Omega Bio-Tek公司的“Stool DNA Kit”產品和“Tissue DNA Kit”產品，

1.3 主要儀器設備 ABI QuantStudio 5實時熒光PCR儀，ABI QuantStudio 7實時熒光PCR儀，eppendorf 5424R高速冷凍離心機。

1.4 引物探針設計 在NCBI GenBank基因庫中，針對細粒棘球絳蟲(MN787561.1)、多房棘球絳蟲(AB777918.1)、少節棘球絳蟲(AB208545.1)、福氏棘球絳蟲(AB208546.1)和石渠棘球絳蟲(AB159139.1)線粒體COX1基因序列，選擇高度同源區域(圖1)，利用生物分析軟件OLIGO 7.0設計一組特異性引物、探針(表1)。引物、探針均由賽默飛公司合成。

圖1 5種絳蟲蚴COX1部分序列比對及特異性引物結合位點

表1 棘球絳蟲引物和探針序列

1.5 樣本DNA提取 按照Omega Bio-Tek公司的“Stool DNA Kit”產品和“Tissue DNA Kit”產品的使用說明書提取。糞便樣本使用“Stool DNA Kit”產品提取，病變組織樣本使用“Tissue DNA Kit”產品提取。

1.6 反應體系和擴增程序 反應體系(25 μL)：實時熒光PCR反應試劑(2×)12.5 μL，上游引物(10 μmol/L)1 μL，下游引物(10 μmol/L)1 μL，探針(10 μmol/L)0.5 μL，DNA模板5 μL，滅菌超純水補至25 μL。

擴增程序：95 ℃ 5 min；(95 ℃ 15 s，55 ℃ 30 s)×40個循環，55 ℃ 30 s處收集熒光，報告基團為FAM。

1.7 方法建立 使用陽性質粒，通過預實驗對反應條件、反應程序等參數進行測試，包括引物探針濃度、擴增程序參數。

1.8 靈敏度試驗 將陽性質粒以10倍梯度進行稀釋，對經梯度稀釋的陽性質粒分別使用上述1.6反應體系和擴增程序進行熒光PCR檢測，驗證所建立方法的靈敏度。

1.9 特異性試驗 以1.1中的犬弓首蛔蟲、多頭絳蟲、豬帶絳蟲、牛帶絳蟲基因組DNA為模板，再取1.8中稀釋的陽性質粒為陽性對照，使用上述1.6中的反應體系和反應程序進行熒光PCR檢測，驗證所建立方法的特異性。

1.10 樣本檢測 取1.1中樣本提取的DNA作為模板，再取1.8中稀釋的陽性質粒為陽性對照，按照1.6中的反應體系和反應程序進行熒光PCR檢測，并與中國疾病預防控制中心寄生蟲病預防控制所提供的結果進行對比，以檢驗所建立方法對樣品的檢測情況。

2 結 果

2.1 樣本信息 動物病變組織樣本均為天之泰生物技術研究院(珠海)有限公司解剖并提供發生明顯病變的樣本，牛肺臟病變組織獲取囊液的過程見圖2。

圖2 從病變牛肺臟中收集囊液

2.2 方法 結合引物探針Tm值的大小，在退火階段使用梯度功能分別進行53 ℃、55 ℃、57 ℃反應，測試不同退火溫度。確定退火溫度后，對引物探針分別使用3種用量進行比對測試(引物探針濃度均為10 μmol/L)，根據擴增曲線形狀、Ct值大小和熒光值綜合判定，最終確定在55 ℃退火，上游引物1 μL、下游引物1 μL、探針0.5 μL的條件為最優，見圖3、圖4。

圖3 不同退火溫度結果對比

1：Forward primer 1 μL，Reverse primer 1 μL，Probe 1 μL；2：Forward primer 1 μL，Reverse primer 1 μL，Probe 0.5 μL；3：Forward primer 0.5 μL，Reverse primer 0.5 μL，Probe 0.25 μL

2.3 靈敏度試驗 取1.1中的重組質粒作為模板，以10倍梯度稀釋作為陽性樣品，取107～100共8個梯度的陽性質粒，共出現8個擴增曲線，檢出的最低濃度梯度是101copies/μL。曲線從左到右依次為107～100，見圖5。

圖5 靈敏度試驗結果

2.4 特異性試驗 本研究所建立的方法對犬弓首蛔蟲、多頭絳蟲、豬帶絳蟲、牛帶絳蟲的檢測均未出現擴增曲線，特異性效果良好，見圖6。

N：Negative control; P:positive control

2.5 樣本檢測 根據所建立的檢測方法對上述84份犬糞樣本和18份病變組織樣本及其囊液樣本進行檢測。結果顯示，84份犬糞中共有41份樣本為陽性，43份樣本為陰性，其中19號和30號樣本熒光PCR結果均為陰性，與中國疾病預防控制中心寄生蟲病預防控制所結果不一致，符合率為97.6%；病變組織樣本18份均為陽性，結果與解剖情況完全一致。以上所有陽性結果均出現顯著的擴增曲線，見圖7、圖8。

N：Negative control；P：Positive control

N：Negative control；P：Positive control

3 討 論

我國棘球蚴病主要流行的地區基本為牧區或半牧區，這些地區環境復雜，常有野生動物出沒，有開放的溪水等水源，故傳染源分布廣泛。調查研究表明，犬是人類和畜牧動物感染棘球蚴病的重要傳染源，且犬等終末宿主的糞便會對環境造成污染，包括土壤和水源等，使人和畜牧動物被感染；家庭屠宰、隨意丟棄患病的動物內臟又易讓犬、野生動物等終末宿主進食后感染棘球絳蟲，進而使人和畜牧動物增加患病風險。因此，對糞便、動物內臟、土壤[4]、水源甚至種植的蔬菜水果[5]等進行檢測意義重大，可以在消滅傳染源、切斷傳播途徑兩個方面預防和控制棘球蚴病。

目前棘球蚴病的檢測手段主要包括影像學診斷[6]、免疫學檢測[7]和核酸檢測[8-9]。影像學在人群篩查方面是主要的臨床診斷方法，有著準確、直觀等優勢，便攜式超聲設備的成熟也使得影像學在對動物現場診斷方面實現了突破。免疫學以ELISA最為常見，在流行病學調查方面，可通過對血清抗體和糞樣中的抗原進行檢測，了解流行情況和推測未來趨勢。核酸檢測技術可以實現不同來源樣本檢測的需求，使用合適的DNA提取試劑盒即可進行后續檢測，相比其它兩類方法還有著高特異性和高靈敏度的特點，檢測通量大，在早期診斷中優勢明顯。綜上所述，核酸檢測方法更適用于棘球絳蟲的終末宿主感染檢測、中間宿主病變組織檢測和環境污染監測。核酸檢測常見有普通PCR、熒光PCR、LAMP和RPA/RAA等方法，其中以熒光PCR在操作性、檢測時間、結果靈敏度、特異性和穩定性等方面均有出色的表現，在此次的新冠病例的診斷和篩查中被廣泛應用。目前國內熒光PCR的試劑和儀器產業鏈完善，檢測成本相比以往大大降低，現已廣泛應用于病毒[10]和寄生蟲病[11]等領域的檢測。

本研究成功建立了一種基于實時熒光PCR檢測棘球絳蟲的檢測方法，理論上適用于任何含有棘球絳蟲、蟲卵或幼蟲的樣本。該方法靈敏度高，可以檢測到濃度為10 copies/μL，可適用于檢測犬糞等目的基因含量不高的樣本，在提取時建議使用專用提取試劑盒，這類試劑盒在提取過程中可以有效去除糞便中的各種污染物和影響PCR的抑制因子，并高效回收DNA，達到下游實驗的要求，而一般的提取試劑盒無法達到要求，會影響后續的實驗結果。試驗中的犬糞樣本為天之泰生物技術研究院(珠海)有限公司通過ELISA方法檢測后的剩余樣本，ELISA方法對犬糞樣本進行前處理時，通過在糞樣中加樣品稀釋液后震蕩混懸，最后離心取上清的方式進行試驗，針對部分離心后不能吸取上清的糞樣，則重復以上步驟直至獲取上清。本研究方法檢測樣本時，部分樣本出現了Ct值偏高，其中19號和30號樣本出現了未檢出的情況，可能與ELISA試驗中，部分樣本因復檢而重復前處理步驟，導致剩余樣本中蟲卵含量過少，影響目的基因提取有關。本研究作為通用型的棘球絳蟲檢測方法，無法鑒別蟲種，在今后的研究可繼續完善，例如可通過多重熒光PCR或普通PCR測序實現。

利益沖突：無

引用本文格式：趙福振，都勇，蔣曉霞，等.實時熒光PCR檢測棘球絳蟲方法的建立及應用[J].中國人獸共患病學報，2022，38(1)：29-34.DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2021.00.179