沉默法尼基轉移酶對人涎腺腺樣囊性癌細胞遷移、侵襲及上皮間充質轉化的作用

李文健 童磊 王奇民 韓紅鈺 陳正崗

1.青島大學附屬青島市市立醫院口腔醫學中心，青島 266071；2.大連醫科大學口腔醫學院，大連116044

涎腺腺樣囊性癌（salivary adenoid cystic carci‐noma，SACC）是常見的上皮源性惡性腫瘤，約占涎腺惡性腫瘤的30%，具有早期血行播散，肺轉移率高以及嗜神經生長等特點[1]，5 年生存率為70%～90%，但在發生遠處轉移的病例中，5年生存率驟降至20%左右[2]。因此，闡明影響SACC 侵襲遷移的可能機制對其臨床治療有重要意義。

RAS 家族基因包括HRAS、KRAS、NRAS，其編碼合成的RAS 蛋白作為三磷酸鳥苷（guano‐sine triphosphate，GTP）結合蛋白家族中的一員，能夠調控細胞的生長發育，同時其異常激活可影響包括PI3K/蛋白激酶B（protein kinase B，AKT）在內的多種下游信號通路，促進人類惡性腫瘤的發生發展[3-4]。法尼基轉移酶（farnesyltransferase，FTase）屬于異戊二烯基轉移酶家族，能夠識別RAS 蛋白C 端CAAX 序列，使法尼基團轉移到半胱氨酸的殘基上，從而完成異戊二烯化修飾，此為RAS 蛋白與細胞膜穩定結合，參與調控惡性腫瘤細胞各種生物學行為的必要條件[5-7]。RAS 家族蛋白均能在穩定狀態下進行異戊二烯化，其中KRAS、NRAS 都能被其他異戊二烯基轉移酶識別，僅有HRAS 只能被FTase 識別修飾后發揮作用[8]，因此在FTase 功能被抑制時，HRAS 蛋白的異戊二烯化就無法正常進行，導致其不能精準定位于細胞膜上，致癌能力減弱[9]。研究[10-12]證明，抑制FTase 活性可對多類HRAS 高表達的惡性腫瘤進展產生較大影響，但對SACC的影響及相關機制尚未明確。

侵襲與遷移一般出現于惡性腫瘤發展的中后期，是影響惡性腫瘤預后的關鍵生物學行為。研究證實上皮間充質轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）可以使腫瘤細胞獲得部分間質細胞表型，從而增強其遷移侵襲能力，是調控包括SACC 在內的多種惡性腫瘤遷移侵襲的關鍵機制。本研究使用小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）干擾技術于體外沉默FTase，檢測其對人SACC 細胞SACC-LM、SACC-83 侵襲遷移及EMT 的影響，探討其作用機制，以期為臨床靶向治療藥物發展提供參考。

1 材料和方法

1.1 主要材料和試劑

人SACC 細胞系SACC-LM 購自上海中喬新舟生物科技有限公司，SACC-83 由山東大學口腔醫學院饋贈。根據人FTase基因設計合成的siRNA 購自廣州銳博生物科技有限公司；RPMI-1640 培養基、0.25%胰蛋白酶（Gibco公司，美國），胎牛血清（BI 公司，以色列），Lipofectamine 2000（Invi‐trogen 公司，美國），TB Green Premix Ex TadTM試劑盒（TAKARA 公司，日本），實時熒光定量聚合酶鏈反應（quantitive real-time polymerase chain re‐action，qRT-PCR）引物FTase、HRAS、磷酸甘油醛脫氫酶（glyceraldehyde phosphate dehydrogenase，GAPDH）合成（上海生工生物工程有限公司）；兔抗人多克隆抗體FTase、HRAS、上皮鈣依賴黏附蛋白（E-cadherin）、波形蛋白（Vimentin）、基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）-9、AKT、磷酸化-AKT（phospho-AKT，p-AKT）、p65、磷酸化p65（phospho-p65，p-p65）、羊抗兔-辣根過氧化物酶二抗（Abcam 公司，英國），Tran‐swell小室（Corning公司，美國）。

1.2 細胞培養

人SACC 細胞SACC-LM 和SACC-83 于37 ℃、5%CO2、飽和濕度的環境下使用RPMI-1640 培養基（10%胎牛血清）進行培養，細胞密度達80%左右時，使用0.25%胰蛋白酶消化，終止消化后收集細胞懸液，加入培養基反復吹打，按1∶3 比例傳代。

1.3 siRNA轉染

根據人FTase 基因序列合成3 條siRNA（表1）和1 條陰性對照序列NC-siRNA，使用處于對數生長期的SACC-LM 和SACC-83 細胞，以2×105個/孔的密度接種于六孔板中，培養至細胞密度達30%～50%時進行轉染操作。待轉染24 h 后，檢測基因的表達。后續實驗分為三大組進行：實驗組（FTase-siRNA-1 組、FTase-siRNA-2 組、FTase-siR‐NA-3 組），陰性對照組（NC-siRNA 轉染組），空白對照組（僅加入轉染試劑）。

表1 3條FTase-siRNA序列Tab 1 Three FTase-siRNA sequences

1.4 qRT-PCR 檢測各組細胞FTase 以及HRAS 的mRNA表達

siRNA 轉染24 h 后，使用RNA 提取試劑盒于轉染后的各組細胞中提取RNA，檢測濃度純度后進行逆轉錄反應，各組均取1 μL 互補DNA（com‐plementary DNA，cDNA）為模板進行聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增反應，以GAPDH為內參，每組均設3個平行副孔。FTase引物序列：上游5’-GGTGGATGTGAGAAGCG‐CATA-3’，下游5’-GGCCAGGCCACAGAAGG‐TATA-3’；HRAS 引物序列：上游5’-GGCAG‐GAGACCCTGTAGGAG-3’，下游5’-GGTTCACCTGTACTGGTGGAT-3’；GAPDH 引物序列：上游5’-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3’，下游5’-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3’。按照試劑盒說明配置PCR 反應體系。使用2?ΔΔCt公式量 化FTase 及HRAS mRNA 的相對表達水平。在經FTase-siRNA 處理的3 個實驗組中，選取FTase mRNA 相對表達量最低，即FTase 沉默效率最高者進行后續實驗。

1.5 蛋白質免疫印跡法（Western blot）檢測目的蛋白的表達

siRNA 轉染24 h 后，取出各組細胞，磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffered saline，PBS）洗滌，加入RIPA 裂解液提取各組細胞總蛋白，使用BCA試劑盒測定蛋白質濃度。每泳道取50 μg 待測樣本，在10%聚丙烯酰胺凝膠中電泳分離，濕轉法將蛋白轉移到聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidene flu‐oride，PVDF）膜上。脫脂牛奶室溫封閉1 h，分別加入FTase（1∶1 000）、HRAS（1∶1 000）、p65（1∶1 000）、p-p65（1∶500）、MMP-9（1∶500）、AKT（1∶1 000）、p-AKT（1∶1 000）、Vi‐mentin（1∶1 000）、E-cadherin（1∶1 000）等抗體，4 ℃過夜。洗膜3 次后，加入二抗（1∶10 000）室溫下孵育1 h，TBST 緩沖液充分漂洗。應用化學發光系統顯影，凝膠成像系統拍照，使用Image J 軟件測定各組蛋白灰度值，以分析蛋白相對表達水平。

1.6 Transwell 細胞侵襲實驗

siRNA 轉染24 h 后，取出各組細胞進行消化、離心，PBS 緩沖液沖洗后加入無血清培養基調整密度至每毫升3×105個。取500 μL 細胞懸液接種于Transwell 小室的上室（實驗前Matrigel 膠已解凍并分裝，均勻鋪于上室），取750 μL 含10%胎牛血清的RPMI-1640 完全培養基，培養箱中孵育48 h 后取出，去除孔中培養液，PBS 沖洗，使用棉簽拭去上室內的未遷移細胞，4%多聚甲醛固定20 min，0.1%結晶紫染色15 min，PBS 再次沖洗后隨機選取5 個區域觀察拍照，計算穿膜細胞數量。

1.7 細胞劃痕實驗

siRNA 轉染24 h 后，取出各組細胞，消化后重懸，以每孔5×105個的密度接種于六孔板上，加入3 mL 完全培養基后繼續培養24 h，待細胞密度達90%左右時，使用200 μL 無菌移液槍頭在孔中央垂直劃過單層細胞，移液管吸取PBS 緩沖液輕吹3 次，繼續培養，分別于0、24 h 時于顯微鏡下取樣拍照，使用Image J 測量劃痕距離，得出相對愈合面積。相對愈合面積=（0 h 劃痕面積?24 h 劃痕面積）/0 h劃痕面積。

1.8 統計學分析

使用SPSS 18.0及GraphPad Prism 8.0分析各組結果，使用t檢驗進行組間兩兩比較，多組間比較使用單因素方差分析，以P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 FTase、HRAS的mRNA表達

qRT-PCR 結果顯示，FTase-siRNA-1 組和FTase-siRNA-2 組的FTase mRNA 表達水平顯著低于空白對照組及陰性對照組（P<0.05）（圖1），其中FTase-siRNA-1 組FTase mRNA 表達水平最低，證明其siRNA 序列沉默效率最高，選為實驗組進行后續研究。各組細胞HRAS 的mRNA 表達差異無統計學意義（P>0.05）。

圖1 轉染后FTase、HRAS mRNA的表達Fig 1 Expression of FTase and HRAS mRNA after FTase-siRNA transfection

2.2 各組細胞FTase、HRAS的蛋白表達

Western blot 實驗結果顯示，FTase-siRNA-1 組FTase 蛋白表達水平顯著低于空白對照組及陰性對照組（P<0.05）。各組細胞HRAS 總蛋白表達水平無明顯差異（P>0.05），FTase-siRNA-1組HRAS膜蛋白表達水平較空白對照組及陰性對照組明顯下降（P<0.05）（圖2）。

圖2 轉染后FTase、HRAS相關蛋白的表達Fig 2 Expression of FTase and HRAS protein in each group

2.3 各組細胞EMT和侵襲遷移相關蛋白的表達

Western blot 實驗結果顯示，FTase-siRNA-1 組較空白對照組及陰性對照組上皮性分子標志物Ecadherin 蛋白表達水平明顯升高（P<0.05），間質性分子標志物Vimentin、MMP-9 蛋白表達水平明顯下降（P<0.05）（圖3）。

圖3 轉染后EMT和侵襲遷移相關蛋白的表達Fig 3 Expression of invasion and migration and EMT related proteins

2.4 RAS/PI3K/AKT/核因子-κB 信號通路的相關蛋白表達變化

Western blot 實驗結果顯示，FTase-siRNA-1 組AKT、p65蛋白表達水平較空白對照組、陰性對照組無明顯變化（P>0.05）。但p-AKT、p-p65 蛋白表達水平明顯下降（P<0.05）（圖4）。

圖4 轉染后RAS/PI3K/AKT/核因子-κB信號通路的相關蛋白表達變化Fig 4 Expression of RAS/PI3K/AKT/nuclear factor-κB signaling pathway proteins

2.5 各組細胞的侵襲能力變化

Transwell 實驗結果顯示，與空白對照組以及陰性對照組相比，FTase-siRNA-1 組穿膜細胞數量顯著減少，證明FTase-siRNA-1 組細胞侵襲能力降低（P<0.05）（圖5）。

2.6 各組細胞的遷移能力變化

細胞劃痕實驗結果顯示，24 h時FTase-siRNA-1組細胞劃痕的愈合速度顯著低于空白對照組及陰性對照組（P<0.05），證明其遷移能力明顯降低（圖6）。

3 討論

SACC是一類發生于頭頸部的高度惡性腺上皮來源腫瘤，其生長緩慢，發病較為隱匿，同時具有高血行轉移率、嗜神經生長性及肺轉移性的特點，導致術后復發率高，預后較差[13]。由于對其發病機制認識有限，目前常規的治療手段仍為手術擴大切除聯合術后放療，而效果不佳[14]。因此，積極探討影響SACC遷移侵襲的相關分子靶點及信號通路有望為其基因治療提供新的思路。

RAS 家族基因是最常見的原癌基因之一，與人類惡性腫瘤的發生、發展密切相關，其點突變可降低p21 在內的GTP 酶活性，限制其表達產物RAS 蛋白與二磷酸鳥苷（guanosine diphosphate，GDP）的結合能力，造成調節失控，導致細胞增殖及惡變[15-16]。RAS的3種亞型HRAS、KRAS、NRAS的突變在各類癌癥中顯示出差異性，在唾液腺惡性腫瘤中，RAS 總突變率為26%，其中HRAS 占比高達15%[17]。HRAS 突變與SACC 較強的侵襲和轉移能力密切相關[18]，且參與其肺轉移過程[19]。

目前，關于RAS 家族蛋白的研究已取得里程碑式進展，發現了RAS 蛋白c 端的翻譯后修飾可將親水蛋白靶向轉移到細胞膜上，為相關酶的研究提供了理論基礎[20-21]，學者們[22]開始研究翻譯后修飾酶抑制劑作為潛在的靶向治療藥物，用于治療RAS驅動癌癥的可能性。FTase作為修飾酶參與RAS 蛋白翻譯后修飾的第一步即異戊二烯化，相當于信號傳導的開關，是RAS 蛋白在細胞膜上精準定位進而發揮生物活性的必要條件[23-24]。FTase由α 與β 亞單位組成，其中α 亞單位與另一個參與異戊二烯化的修飾酶GGTase Ⅰ相同，而β 亞單位識別底物序列，決定了底物的特異性。在RAS 蛋白所有亞型的異戊二烯化修飾過程中，僅HRAS只能特異性的被FTase 修飾，因此抑制FTase 活性可使HRAS 蛋白的致癌能力大幅減弱。有臨床研究提示，FTase 抑制劑類藥物對乳腺癌、胃癌、肺癌和肝癌等多類惡性腫瘤都有較好的治療效果，但FTase 對SACC 的影響及作用機制尚未有相關文獻報道。本研究采用siRNA 轉染人SACC 細胞SACC-LM 及SACC-83，抑制其FTase 表達，檢測其對HRAS 的影響，結果顯示HRAS mRNA 及總蛋白的表達水平無明顯改變，HRAS膜蛋白的表達水平降低。由此推測在SACC 細胞中，FTase 可通過影響HRAS 的異戊二烯化修飾，干擾其與細胞膜的穩定結合，降低HRAS活性，而對HRAS本身表達并無明顯影響。EMT 指上皮細胞失去細胞極性，獲得部分間充質細胞的特征，表現為上皮標志物如E-cadherin 的丟失，間質性標志物如N-cad‐herin、Vimentin、MMP-9的增加，細胞的侵襲和遷移能力大大增強，目前EMT被認為是包括SACC在內的多種惡性腫瘤遷移侵襲的關鍵。MMP-9 又被稱為明膠酶B，屬MMP 家族，腫瘤發生發展過程中造成的缺氧缺血環境會使其表達水平上調，降解細胞外基質及基底膜上的膠原，造成腫瘤細胞向遠處遷移，MMP-9 與SACC 的局部復發、遠處轉移有關，可作為評價患者預后的指標。本實驗中，抑制FTase表達后，EMT相關的上皮性分子標志物E-cadherin 表達升高，間質性分子標志物Vi‐mentin 及MMP-9 表達降 低，Transwell 侵 襲實驗 及劃痕實驗顯示細胞遷移侵襲能力下降，推測沉默FTase 通過降低HRAS 蛋白活性影響了HRAS 蛋白對下游信號分子及通路的調控作用，抑制了SACC細胞的上皮間充質轉化，從而影響了細胞的侵襲遷移能力。

PI3K是一種具有催化活性的細胞內信號蛋白，可調控下游AKT 磷酸化水平，二者構成PI3K/AKT信號通路。核因子-κB作為多種信號通路匯合的關鍵點，激活后可影響細胞的各類生物學行為，促進腫瘤的發生發展。核因子-κB 家族包括核因子-κB1（p50）、核因子-κB2（p52）、RelA（p65）、RelB 和c-Rel，通常所說的核因子-κB 蛋白是指p65/p50 亞單位形成的二聚體蛋白，其中p65 的磷酸化是核因子-κB 進行轉錄的必要條件。有研究顯示，PI3K/AKT 通過靶向調控核因子-κB，在多種腫瘤細胞的侵襲遷移中起到重要作用。RAS 基因是PI3K-AKT 信號通路的上游調控基因，其中HRAS 相較于其他家族成員能夠更加有效地激活PI3K 信號通路。為進一步探討FTase對SACC 細胞侵襲轉移影響的分子機制，本研究應用Western blot檢測RAS/PI3K/AKT信號通路的關鍵分子AKT及其磷酸化水平，結果顯示與兩對照組相比，轉染FTase siRNA 后，細胞AKT 蛋白表達無明顯差異，AKT 蛋白的活性形式p-AKT 較對照組明顯下降，p65 蛋白表達水平無明顯差異，而p-p65 蛋白表達降低，表明抑制FTase 表達后，SACC 細胞內RAS/PI3K/AKT/核因子-κB 通路級聯反應的作用明顯減弱，使其侵襲遷移能力下降。

綜上所述，本實驗利用siRNA 技術抑制了人SACC 細胞SACC-LM 及SACC-83中FTase的表達，使細胞侵襲遷移能力顯著下降，由此推測其作用可能是通過影響HRAS 蛋白的異戊二烯化修飾，干擾其靶向膜定位，使其無法有效激活下游RAS/PI3K/AKT/核因子-κB 信號通路，進而抑制細胞EMT進程而實現的，該研究為FTase作為SACC 基因治療的有效靶點提供了一定依據，其具體機制仍待進一步研究。

利益沖突聲明：作者聲明本文無利益沖突。