試管凝集試驗與微量凝集試驗檢測奶牛布魯氏菌病效果比較

高軍軍，宋建國，車小蛟，孟林明，韓慶彥

（甘肅省動物疫病預防控制中心，甘肅 蘭州 730030）

布魯氏菌病是一種人畜共患傳染病，多發于牛羊[1]。牛羊布病主要以母畜流產、死胎和公畜睪丸腫大發炎為主要特征；人布病臨床癥狀主要表現為乏力、睪丸炎、流產、慢性關節病變等，嚴重影響勞動能力[2]。為了探究試管凝集試驗與微量凝集試驗檢測奶牛布魯氏菌病的效果，開展本試驗。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1主要試劑 布魯氏菌病試管凝集抗原批號010042003，每瓶10 ml，陽性對照批號010061901，陰性對照批號010051904，購自青島立見生物科技有限公司；布魯氏菌病試管凝集抗原批號20191030，每瓶15 ml，陽性對照批號201702，每瓶1 ml，陰性對照批號201501，每瓶1 ml，中國獸醫藥品監察所提供。0.5%石碳酸由甘肅省動物疫病預防控制中心實驗室配制。

1.1.2樣品來源 將保存的未免疫布病疫苗（A19）的奶牛血清146份樣品，通過虎紅平板凝集試驗篩選出15份凝集血清，將15份血清樣品和6份已知盲樣用布病凝集試驗的常量法和微量凝集試驗進行復核比較。

1.1.3實驗器材 電熱恒溫培養箱（德國邁德賽有限公司）；單、多道已經校正過的移液槍（10～100 μl、100～1000 μl單道移液槍等，德國艾本德股份公司）；滅菌槍尖、96孔U型微量板、試管架、凝集玻璃試管（可用未添加抗凝劑的5 ml或3 ml真空采血管替代）、一次性96孔封口膜、濕盒、振蕩器、分析天平、恒溫培養箱、校準過的溫度計等。

1.2 試驗方法

1.2.1試管凝集試驗（SAT）抗原及陰陽性對照在使用前室溫放置20～40 min。每份血清需要4支凝集玻璃試管，依次編號1～4，第1支試管加入960 μl稀釋液，第2～4管各加入500 μl稀釋液[3]，將40 μl虎紅抗體陽性奶牛血清（包括陰陽性對照）加入第1管，按1～4管順序（量程調到500 μl）倍比稀釋到第4管，第4管棄去500 μl，振蕩器混勻，第1～4管的血清滴度變為1∶25、1∶50、1∶100和1∶200，然后在1～4管中加入500 μl抗原（1∶20稀釋），則第1～4管血清滴度變為1∶50、1∶100、1∶200、1∶400，比濁管（抗原1∶40稀釋）的配制同時進行，緩慢放入37 ℃電熱恒溫培養箱孵育22 h，取出觀看結果[3]。

“++++”表示菌體100%凝集，“++”是比較難觀察的，和各加了0.5 ml稀釋液和抗原（抗原1∶40稀釋）的比濁管透亮度一樣，但管底的沉淀有差別，主要看清亮度，清亮度與相對應比例的比濁管比較，下層凝集物程度也可以作為參照。判定標準注重人為差異，防止搖動，在自然光下按要求觀察上清，再結合管底層凝集程度判定結果。奶牛血清滴度在1∶100出現兩個“++”及以上，就判為陽性，奶牛血清滴度在1∶50出現兩個“++”及以上，判為可疑。

1.2.2微量凝集試驗（MSAT）抗原及陰陽性對照恢復室溫20～40 min，在96孔U型微量板上操作，每份奶牛血清需要4個連續孔，第1孔中加入192 μl稀釋液，第2～4孔中加入100 μl稀釋液，將8 μl虎紅抗體陽性奶牛血清（包括陰陽性對照）加入第1孔中（血清25倍稀釋），用12道排槍（量程調到100 μl）從第1～4孔進行倍比稀釋，第4孔棄去100 μl，第1～4孔的樣品稀釋比例變為1∶25、1∶50、1∶100、1∶200。將100 μl抗原（1∶20稀釋）加入每個稀釋過的孔中，第1～4孔奶牛的血清稀釋比例翻倍，變為1∶50、1∶100、1∶200、1∶400。先用封口膜粘住，振蕩器上混勻2～3 min，放濕盒內置37 ℃恒溫培養箱孵育22 h，取出觀看結果并做好原始記錄[3]。

“++++”表示孔底凝集物呈片狀凝集于孔底（100%凝集），“+++”表示孔底凝集物基本呈片狀凝集，開始出現極少量白色點狀凝集（75%凝集），“++”表示出現明顯的白色點狀凝集（50%凝集），“-”表示孔底全是白色點狀凝集（沒有凝集）。結果判斷時須同時觀察60°傾斜時白色點狀流動情況，如“++”會出現明顯的白色點狀凝集，且60°傾斜時白色點狀凝集大部分流動。奶牛血清樣品第2孔（滴度1∶100）出現兩個“++”，就判為陽性，滴度越高孔底凝集越徹底，陽性就越強；在樣品第2孔（滴度1∶100）出現一個“+”或第1孔（滴度1∶50）出現“++”及以上，判為可疑，需要四周后重復采集之前奶牛樣品，如果仍為可疑判陽性[4]。

2 結果與分析

試管凝集試驗（SAT）與微量凝集試驗（MSAT）結果見表1。在完全一樣的條件下（試劑、耗材、試驗條件、人員），SAT和MSAT陰陽性對照成立，抗原沒有發生自凝，試驗成立。15份奶牛樣品中，試管凝集抗體陽性10份，陰性5份；微量凝集抗體陽性10份，可疑2份，陰性3份。用青島立見生物科技有限公司的抗原做了多次重復試驗，試驗結果一致；換中國獸醫藥品監察所的抗原，試驗結果一致。奶牛場將這兩頭可疑的奶牛進行隔離飼養，一個月后重新采樣檢測，用MSAT和SAT兩種方法和兩種試劑進行比對試驗，試驗結果完全一致，一份奶牛轉為陽性，一份變為陰性，之后對該奶牛場進行了全群布病監測及凈化。6份已知盲樣用凝集試驗中的微量凝集試驗和常量法進行方法比對，試驗結果見表2。兩種試驗盲樣比對結果一致，用兩種試劑分別對兩種試驗方法進行比對，結果也完全一致，兩種試驗重復性好，MSAT結果準確。

表2 6份布病已知盲樣試管凝集試驗和微量凝集試驗結果對比

3 討論

用兩種有資質廠家的試劑進行多次重復試驗，結果一致，重復性良好，SAT和MSAT兩種試驗一般用于布病虎紅平板抗體陽性確診，不適合初篩[5]。對試管凝集陰性但有滴度的樣品及可疑樣品要高度重視，四周后持續采樣進行監測，防止漏檢誤檢，一旦發現布病抗體陽性且有臨床癥狀的奶牛，需要每年對全群進行2～3次凈化監測，直至連續兩次全群布病檢測都為抗體陰性[6]。試管凝集試驗檢測過程比較繁瑣，費時費力，結果判定受人為因素影響較大，而微量凝集試驗操作過程更簡便精確，節約試劑耗材，試驗結果更容易準確判斷，穩定性和特異性也較高。

基層一般用虎紅平板凝集試驗進行初篩，用試管凝集試驗、微量凝集試驗和常量法及熒光PCR進行確診，由于布魯氏菌病實時熒光PCR檢測費用高，人員要求和實驗室設備要求也比較高[7]，基層實驗室很少用這種方法。MSAT被納入GB/T 18646—2018其中，經過多次重復試驗結果可靠，MSAT特異性與SAT基本無差別，相比試管凝集試驗有一定的優勢（無論是操作過程或費用），建議基層獸醫實驗室推廣應用。