基于葡萄有機酸的稀有人參皂苷20(S,R)-Rg3和Rg5的綠色制備

張浩然，朱小涵，趙 迅，李 玲，成樂琴*

(1.吉林化工學院 化學與制藥工程學院,吉林 吉林 132022；2.吉林省長春市公安司法鑒定中心，吉林 長春 130000；3.通化百奧金森生物科技有限公司，吉林 通化 134000)

人參在東亞國家作為一種預防和滋補劑已有幾千年的歷史，是一種廣受歡迎的草藥，在癌癥、心血管、免疫和中樞神經系統疾病等領域有多種藥用功效[1-3].人參包含人參皂苷、人參多肽、人參多糖等成分[4]，其中人參皂苷因其在抗炎、抗應激、抗氧化、抗腫瘤和免疫調節等方面的良好作用得到了廣泛的研究[5-8].原人參皂苷主要由Rb1、Rb2、Rc、Rd、Re、Rg1組成，占人參總皂苷含量的90%[9]，而大量研究表明，通過原人參皂苷的結構轉化得到的次級稀有人參皂苷20(S,R)-Rg3和Rg5在抗癌、抗炎、改善記憶力等[10-13]方面顯示出更強的藥理活性，具有更大的藥用價值，因此稀有皂苷20(S,R)-Rg3和Rg5的制備具有重要意義.

稀有人參皂苷20(S,R)-Rg3和Rg5可從紅參或黑參中分離[14-15]，但紅參或黑參加工時間長，稀有皂苷含量偏低.目前常用制備方法主要有酸水解法、微生物轉化法及酶催化法[16-18]，其優點是可以提高稀有人參皂苷的收率和選擇性，但成本高或環境不友好.

葡萄是世界上種植最廣泛的一種大宗水果，含有較豐富的酒石酸、蘋果酸、檸檬酸等有機酸[19].在前期研究天然檸檬汁催化人參須根粉制備20(S,R)-Rg3和Rg5工藝[20]基礎上，本文以葡萄汁作為酸的來源，以自制改良索氏提取器作為提取裝置，研究從人參須根粉一步制備稀有人參皂苷Rg3、Rg5的方法，并進行工藝條件優化，為保健食品和功能性食品的研發提供更綠色、更價廉的原料支持.

1 原料與方法

1.1 原料和試劑

葡萄，吉林市大潤發超市購買，使用前榨汁、過濾；人參須根，吉林市高仕奇參茸店；甲醇(色譜純)，天津市大茂化學試劑廠；乙腈(色譜純)，Tedia company，U.S.；無水乙醇(分析純)，天津市大茂化學試劑廠；純凈水，杭州娃哈哈集團有限公司.

1.2 主要儀器與設備

改良索氏提取器，自制(結構見實用新型專利ZL201720660247.5)；高效液相色譜儀(EC2000)，大連依利特分析儀器有限公司；色譜柱(Pinnacle Ⅱ C18)，Restek U.S.；旋轉蒸發儀(RE202)，日本Yamato；磁力攪拌器(ZNCL-GS 130*60)，鞏義市予華儀器有限責任公司；高速臺式離心機(H1650)，長沙湘儀離心機儀器有限公司.

1.3 實驗原理

由人參須根粉制備稀有人參皂苷20(S,R)-Rg3和Rg5的實驗原理見圖1.

圖1 稀有人參皂苷20(S,R)-Rg3和Rg5的制備原理

1.4 實驗方法

1.4.1 單因素實驗優化工藝條件

在改良索氏提取器的提取筒中放入2 g過100目篩人參須根粉，在提取筒和提取瓶中分別加入20 mL不同濃度的乙醇水溶液，提取瓶中再加入新鮮葡萄汁，放入攪拌子，安裝改良索氏提取器.將裝置中的提取瓶置于油浴中，并在提取筒中通入事先加熱到特定溫度的導熱液，在300 rpm攪拌下加熱攪拌提取.當提取筒出現回流液時打開提取筒下端活塞，至提取劑流入提取筒的速度和提取液流出提取筒的速度基本達到平衡.提取結束，打開提取筒下端活塞，合并提取筒和提取瓶中液體.人參提取物按照文獻[20]的方法進行后處理，經旋轉蒸發儀旋干，溶于色譜醇甲醇超聲溶解后經0.22 μm濾頭過濾進行HPLC定量分析，并計算人參皂苷20(S,R)-Rg3、Rg5的得率.

1.4.2 正交實驗優化工藝條件

在單因素實驗基礎上，選取乙醇濃度(A)，油浴溫度(B)，提取時間(C)3個因素進行L9(34)正交試驗.因素與水平選擇見表1.

表1 L9(34)正交試驗因素與水平

1.4.3 HPLC分析條件

色譜柱：Pinnacle Ⅱ C18(4.6×250 mm,5 μm)；檢測波長：203 nm；柱溫：35 ℃；流速：1.0 m L/min；進樣量：20 μL；流動相：乙腈(A)-純凈水(B)；梯度洗脫程序[21]：0.00～10.00 min，A：22%；10.00～20.00 min，A：22%；20.00～25.00 min，A：27%；25.00～45.00 min，A：31%；45.00～60.00 min，A：38%；60.00～65.10 min，A：52%；65.00～75.00 min，A：52%；75.00～77.00 min，A：55%；77.00～79.00 min，A：90%；79.00～115.00 min，A：22%.

2 結果與討論

2.1 單因素實驗優化提取制備20(S,R)-Rg3、Rg5的工藝條件

2.1.1 乙醇濃度對人參皂苷20(S,R)-Rg3、Rg5得率的影響

為了考察乙醇濃度對人參皂苷20(S,R)-Rg3、Rg5得率的影響，分別以10%、20%、30%、40%、50%乙醇水溶液為提取溶劑，在葡萄汁用量為10 mL、提取筒溫度60 ℃、油浴溫度125 ℃條件下提取人參須根粉3 h.提取物的HPLC 定量分析結果見圖2.

乙醇濃度/%圖2 乙醇濃度對人參皂苷20(S,R)-Rg3、Rg5得率的影響

由圖2可知，乙醇濃度對人參皂苷20(S,R)-Rg3、Rg5得率的影響非常顯著.乙醇濃度過低時會影響提取溶劑的氣化速度，溶劑循環減慢，從而影響對人參皂苷的動態提取效率；而乙醇濃度高時雖然有利于溶劑的循環提取，但由于水含量降低，會影響葡萄汁中有機酸電離H+，從而降低酸催化效果.實驗結果表明，葡萄汁作用下用20%的乙醇作提取劑時人參皂苷20(S,R)-Rg3、Rg5的得率最高.

2.1.2 提取筒溫度對人參皂苷20(S,R)-Rg3、Rg5得率的影響

為考察不同提取筒溫度對人參皂苷20(S,R)-Rg3、Rg5得率的影響，固定20%的乙醇水溶液為提取溶劑、葡萄汁用量10 mL、油浴溫度125 ℃條件下，分別在30、40、50、60、70 ℃提取筒溫度提取人參須根粉3 h，實驗結果如圖3所示.

提取溫度/℃圖3 提取筒溫度對人參皂苷20(S,R)-Rg3、Rg5得率的影響

由圖3可見，提取筒溫度在30～40 ℃時，人參皂苷20(S,R)-Rg3、Rg5的總得率變化不大，但提取筒溫度從40 ℃提高到60 ℃時，20(S,R)-Rg3、Rg5的總得率有明顯增加，而進一步升高溫度時反而有所下降.因此，在下面的實驗中選擇60 ℃提取筒溫度進行了進一步的工藝優化.

2.1.3 油浴溫度對人參皂苷20(S,R)-Rg3、Rg5得率的影響

為了考察油浴溫度對人參皂苷20(S,R)-Rg3、Rg5得率的影響，在20%的乙醇水溶液為提取溶劑、葡萄汁用量為10 mL、提取筒溫度60 ℃條件下，分別在105、115、125、135、145 ℃油浴溫度提取人參須根粉3 h(見圖4).

油浴溫度/℃圖4 油浴溫度對人參皂苷20(S,R)-Rg3、Rg5得率的影響

由圖4可見，隨著油浴溫度的提高，人參皂苷20(S,R)-Rg3、Rg5的得率也隨之升高，當油浴溫度為135 ℃時達到最大值1.41%，這與檸檬汁作用下的油浴溫度相同[21].而油浴溫度進一步提高時總得率明顯下降，這一方面可能由于溫度過高會影響Rg3、Rg5的穩定性，另一方面，油浴溫度還會影響提取溶劑循環的速度，間接影響提取效率.

2.1.4 葡萄汁用量對人參皂苷20(S,R)-Rg3、Rg5得率的影響

葡萄汁含有酒石酸、檸檬酸、蘋果酸等有機酸，這些酸可以作為H+的來源催化人參皂苷的結構轉化反應.為了探索葡萄汁用量對人參皂苷20(S,R)-Rg3、Rg5得率的影響，以20%的乙醇水溶液為提取溶劑，分別加入5.0、7.5、10.0、12.5、15.0 mL葡萄汁，在提取筒溫度60 ℃、油浴溫度135 ℃條件下提取人參須根粉3 h(見圖5).

葡萄汁用量/mL圖5 葡萄汁用量對人參皂苷20(S,R)-Rg3、Rg5得率的影響

實驗結果表明，人參皂苷20(S,R)-Rg3、Rg5的總得率在7.5～10.0 mL范圍內隨著葡萄汁用量的增加而增加，10.0～12.5 mL范圍內幾乎保持不變，進一步提高葡萄汁用量，總得率有所下降.這說明葡萄汁用量過少，酸催化能力低，總得率低；若過多，會導致稀有人參皂苷部分分解，也會使總得率下降，因此選擇葡萄汁用量為10 mL進行了進一步的優化.

2.1.5 提取時間對人參皂苷20(S,R)-Rg3、Rg5得率的影響

為考察不同提取時間對人參皂苷20(S,R)-Rg3、Rg5得率的影響，以20%的乙醇水溶液為提取溶劑，在提取筒溫度60 ℃、油浴溫度135 ℃條件下分別提取人參須根粉1、2、3、4、5 h，結果見圖6.

提取時間/h圖6 提取時間對人參皂苷20(S,R)-Rg3、Rg5得率的影響

提取時間對20(S,R)-Rg3、Rg5得率的影響顯示規律性變化，在提取時間1～4 h范圍內，20(S,R)-Rg3、Rg5的總得率隨著提取時間的增加呈增長趨勢，當提取時間進一步延長至5 h時，20(S)-Rg3的得率有所下降，20(R)-Rg3和Rg5的得率有所增加，而人參皂苷20(S,R)-Rg3和Rg5的總得率基本保持不變.

2.2 正交試驗分析

在單因素實驗的基礎上，為了進一步優化實驗條件，選取對人參皂苷20(S,R)-Rg3、Rg5得率影響較大的乙醇濃度(A)、油浴溫度(B)和提取時間(C)3個因素，每個因素選取3個水平，并以Rg3、Rg5的總得率為考察指標，進行了L9(34)正交試驗.正交試驗結果見表2.

表2 L9(34)正交試驗方案與結果表

極差R的大小可以衡量實驗中各因素對人參皂苷20(S,R)-Rg3和Rg5的總得率的影響大小.由表2可知，A、B和C的極差R分別為0.86、0.36和0.84，說明影響20(S,R)-Rg3和Rg5總得率的因素主次順序為A>C>B，即乙醇濃度(A)的影響最大，提取時間(C)的影響次之，油浴溫度(B)的影響最小.最優實驗方案為A1B1C1，即乙醇濃度20%、油浴溫度145 ℃、提取時間5 h，此時經HPLC(見圖7)定量分析結果顯示，20(S,R)-Rg3和Rg5總得率可以達到2.29%.

保留時間/min圖7 優化條件下人參須根粉提取物的HPLC分析圖

葡萄汁作用下制備富含功能性成分的人參提取物與檸檬汁作用下制備富含功能性成分的人參提取物的優化工藝對比中可知，葡萄汁作酸催化劑的來源時比檸檬汁需要更低的乙醇濃度、更高的油浴溫度和更長的提取時間.

3 結 論

采用鮮葡萄汁中所含有機酸作為酸催化劑，使用自制改良索氏提取器，通過一步法從人參須根粉制備得到了富含稀有人參皂苷Rg3、Rg5的人參提取物.對實驗條件的優化結果表明，乙醇濃度對稀有人參皂苷Rg3、Rg5的制備影響最大，確立的優化條件為乙醇濃度20%、提取筒溫度60 ℃、油浴溫度145 ℃、葡萄汁用量10 mL、提取時間5 h，此時人參皂苷Rg3、Rg5總得率達到2.29%.

用葡萄汁催化制備稀有人參皂苷Rg3、Rg5，不僅過程綠色環保，營養成分流失少，提取物兼具葡萄和人參成分，且Rg3、Rg5等稀有人參皂苷富集，非常適合作保健食品和功能食品原料.