COX抑制劑對壓力超負荷性心肌肥厚大鼠心室重構(gòu)的作用

孫浩榮 魏明慧 范曉梅 薛明明

心肌肥厚是指心肌細胞應(yīng)對增強的心臟后負荷而產(chǎn)生的適應(yīng)性反應(yīng)，早期這種代償性反應(yīng)有利于維持心臟功能，但長期持續(xù)的高負荷狀態(tài)最終會引起心室重構(gòu)、心功能失代償而發(fā)生心力衰竭甚至心源性猝死[1,2]。因此，預(yù)防和改善心肌肥厚的發(fā)生、發(fā)展具有重要意義。

環(huán)氧化酶(COX)有兩種異構(gòu)體COX-1和COX-2，阿司匹林是COX-1和COX-2抑制劑，塞來昔布是COX-2抑制劑。心肌肥厚過程中伴有炎性反應(yīng)發(fā)生，炎性反應(yīng)會趨化大量炎性細胞因子[3]。阿司匹林有抗炎療效并能影響心室重構(gòu)，塞來昔布通過抑制COX-2阻止炎性前列腺素類物質(zhì)的產(chǎn)生，達到抗炎、鎮(zhèn)痛及退熱作用[4，5]。這兩種藥物目前未被納入治療高血壓心肌肥厚臨床用藥指南，且治療機制不明。本實驗將通過腹主動脈縮窄法構(gòu)建心肌肥厚大鼠模型來探討COX抑制劑對壓力超負荷性心肌肥厚大鼠心室重構(gòu)的潛在治療作用及機制，為臨床擴大藥物治療方案提供依據(jù)。

材料與方法

1.藥品與試劑:阿司匹林腸溶片購自辰欣藥業(yè)股份有限公司；塞來昔布膠囊購自輝瑞公司進口分包裝；大鼠TNF-α、IL-10 ELISA 檢測試劑盒購自泉州市睿信生物科技有限公司；蘇木精-伊紅、Masson 三色染色試劑盒購自福州邁新生物技術(shù)有限公司；免疫組化試劑盒購自北京博奧森有限公司。

2.實驗對象及分組：雄性SPF級SD大鼠，體質(zhì)量200±20g，購自長沙市天勤生物技術(shù)有限公司，在內(nèi)蒙古醫(yī)科大學實驗動物中心飼養(yǎng)，生產(chǎn)許可證號：SCXK(湘)2014-0011。將大鼠隨機分為正常對照組、模型組、模型+阿司匹林組、模型+塞來昔布組。

3.動物模型的制備及灌胃處理：正常對照組不作任何處理，其余3組按照Anderson法[6]制造壓力超負荷性心肌肥厚大鼠模型，操作步驟如下：稱體質(zhì)量，用2%戊巴比妥鈉溶液1.0ml/400g(50mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠，麻醉時長為1.5h左右，固定，備皮，消毒，分層開腹，先剪開皮膚，在剪開肌肉層盡量避免剪到小血管，用手術(shù)器械夾住皮膚和肌肉以便獲取良好視野，預(yù)先準備好用鹽水浸泡的棉球，塞入腹腔內(nèi)部，目的是讓腹主動脈更凸顯出來便于操作，在右側(cè)腎動脈上方游離腹主動脈，沿腹主動脈長軸置直徑為0.7mm的針頭，用無菌4號手術(shù)線結(jié)扎腹主動脈及針頭，抽出針頭，此時腹主動脈殘留0.7mm的殘腔。檢查腹腔內(nèi)干凈無遺留物后，肌肉層縫合后噴淋硫酸慶大霉素溶液，皮膚縫合后噴淋硫酸慶大霉素溶液，在大鼠后肢根部用碘伏消毒，肌內(nèi)注射青霉素鈉10萬單位，圍上紗布保溫，肌內(nèi)注射在每天同一時間連續(xù)注射5天。術(shù)后次日起，正常對照組和模型組以0.9%氯化鈉溶液安慰劑2ml/(100g·d)灌胃，阿司匹林組以阿司匹林溶液10mg/(100g·d)灌胃，塞來昔布組以塞來昔布溶液 1.8mg/(100g·d)灌胃，4組大鼠按連續(xù)灌胃時間分為第8、10、12、14周。在構(gòu)建模型及治療中，大鼠因術(shù)中出血、術(shù)后感染及腸梗阻等死亡，死亡率在30%左右，最終造模成功并取材的大鼠為每個時間點每組8只。

4.實驗方法：(1)左心室質(zhì)量指數(shù)測定：取出大鼠心臟后，用預(yù)冷的0.9%氯化鈉溶液清洗心腔，濾紙吸干水分，剔除左心室，稱重后計算左心室質(zhì)量指數(shù)。(2)心肌組織病理學評價：4%多聚甲醛固定左心室組織，梯度乙醇脫水，石蠟包埋，切片4μm。行HE染色，顯微鏡下觀察，計算心肌細胞直徑。Masson染色計算膠原沉積百分比。(3)ELISA 檢測血漿炎性細胞因子：腹主動脈采集血液離心，取上清液至 EP 管，-80℃保存，ELISA 檢測血漿炎性細胞因子 TNF-α、IL-10 的含量。(4)免疫組織化學檢測：取出心臟標本行免疫組化染色，一抗為大鼠Rabbit anti-Notch1 antibody (北京博奧森有限公司，bs-1335R)、Rabbit anti-HEY2 antibody (北京博奧森有限公司，bs-9461R)，二抗為北京博奧森有限公司的二抗試劑盒。

結(jié) 果

1.左心室質(zhì)量指數(shù):第8、10、12及14周模型組內(nèi)左心室質(zhì)量指數(shù)時間依從性增大，正常對照組、塞來昔布組、阿司匹林組組內(nèi)比較，差異無統(tǒng)計學意義。組間比較：在第8周時，模型組與正常對照組比較增大，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，模型組與塞來昔布組、阿司匹林組比較，差異無統(tǒng)計學意義；在第10周時，可能由于個體差異，各組間比較差異無統(tǒng)計學意義；在第12、14周時，模型組與正常對照組比較，顯著性增加(P分別為<0.05、<0.01)，第12周時模型組與塞來昔布組、阿司匹林組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P分別為<0.05、<0.01)；第14周時的阿司匹林與模型組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，而塞來昔布組與模型組比較，差異無統(tǒng)計學意義。在4個時間點中，阿司匹林組與塞來昔布組左心室質(zhì)量指數(shù)比較，差異無統(tǒng)計學意義(圖1)。

圖1 各組大鼠左心室質(zhì)量指數(shù)與正常對照組比較，*P<0.05,**P<0.01；與模型組比較,#P<0.05,##P<0.01

2.HE染色:光鏡下觀察，正常對照組大鼠心肌細胞排列致密有序，間隙較小，細胞大小均勻，胞核大小均一。模型組心肌細胞排列紊亂，細胞間隙增大，心肌細胞出現(xiàn)明顯肥大，細胞核形態(tài)不規(guī)則。阿司匹林組、塞來昔布組較模型組心肌細胞肥大有所緩解，間質(zhì)細胞核明顯減少(圖2)。心肌細胞短軸直徑的測量結(jié)果,第8、10、12、14周4個時間點的模型組細胞短直徑增加明顯與正常對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P分別為<0.05、<0.01)，阿司匹林組、塞來昔布組與模型組比較，細胞短直徑降低明顯，差異有統(tǒng)計學意義(P分別為<0.05、<0.01)，阿司匹林組與塞來昔布組比較細胞短軸直徑差異無統(tǒng)計學意義，但隨著時間延長，加藥處理后的兩組細胞短軸直徑時間依從性減小，阿司匹林組減小更明顯(表1)。

圖2 各組大鼠 HE 染色心肌組織光鏡下病理形態(tài)的改變(×400)

3.Masson染色:各個時間點，正常對照組的視野內(nèi)淡藍色區(qū)域較小，膠原纖維在間質(zhì)內(nèi)呈細絲狀。隨著時間點的延長，模型組心肌纖維化的狀態(tài)越來越嚴重，視野中淡藍色區(qū)域面積越來越大，呈片狀。阿司匹林組、塞來昔布組中膠原纖維稍有增生但不及模型組明顯，增生位置主要在血管周圍(圖3)。計算膠原組織所占百分比，含冠狀動脈小血管視野膠原容積百分比(CVF-T)和無冠狀動脈小血管視野膠原容積百分比(CVF-NV)。測量視野中模型組CVF-T、CVF-NV隨著時間逐漸增大，與正常對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P分別為<0.05、<0.01)；阿司匹林組與模型組比較，膠原容積百分比顯著減小(P分別為<0.05、<0.01)，塞來昔布組CVF-T和CVF-NV測量分別在第10周和第12周開始下降，與模型組比較，膠原容積百分比減小差異有統(tǒng)計學意義(P分別為<0.05、<0.01)。塞來昔布組和阿司匹林組第8周CVF-T比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，表2、表3)。

表1 各組大鼠心肌細胞短軸直徑的比較

圖3 各組大鼠Masson染色心肌組織光鏡下病理形態(tài)的改變(×400)

4.阿司匹林、塞來昔布對心肌肥厚大鼠血漿炎性細胞因子的影響：各個時間點正常對照組血漿TNF-α、IL-10濃度基本維持不變；模型組中的TNF-α、IL-10與正常對照組比較濃度增高，差異有統(tǒng)計學意義(P分別為<0.05、<0.01)。阿司匹林組、塞來昔布組的TNF-α、IL-10與模型組比較濃度降低，差異有統(tǒng)計學意義(P分別為<0.05、<0.01)。對于TNF-α，在第8周時，塞來昔布組顯著高于阿司匹林組(P<0.05)；對于IL-10，塞來昔布組在第8周、第10周時顯著高于阿司匹林組(P<0.01)，隨后兩組炎性細胞因子TNF-α、IL-10含量降至相近(表4、表5)。

表2 各組大鼠膠原纖維CVF-T測量比較

表3 各組大鼠膠原纖維CVF-NV測量比較

5.免疫組化染色結(jié)果:(1)Notch1蛋白:Notch1蛋白以棕黃色顆粒的出現(xiàn)為陽性表達。組間Notch1蛋白含量比較，各個時間點模型組與正常對照組比較表達增高，差異有統(tǒng)計學意義(P分別為<0.05、<0.01)；阿司匹林組在第8、12、14周與模型組比較表達量降低，差異有統(tǒng)計學意義(P分別為<0.05、<0.01)，塞來昔布組在14周時與模型組比較，表達量降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。對于加藥處理的兩組，在第8周和第12周時塞來昔布組蛋白表達量高于阿司匹林組，差異有統(tǒng)計學意義(P分別為<0.05、<0.01)，隨時間延長，阿司匹林組先上升，在第10周達頂峰后下降，塞來昔布則上升至第12周后開始下降，在第14周時差異無統(tǒng)計學意義(圖4、表6)。(2)Hey2蛋白:Hey2蛋白以棕黃色顆粒的出現(xiàn)為陽性表達。在第8、10、12、14周，模型組與正常對照組Hey2蛋白量增高，且差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；阿司匹林組與模型組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。塞來昔布組在第12、14周時與模型組比較，表達量降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。隨時間延長，阿司匹林在第10周時蛋白含量達峰值后開始下降，塞來昔布則在第12周后開始下降，塞來昔布組與阿司匹林組比較，二者差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01，圖5、表7)。

表4 各組大鼠血漿中炎性細胞因子TNF-α的比較

表5 各組大鼠血漿中炎性細胞因子IL-10的比較

圖4 各組大鼠Notch1蛋白免疫組化染色圖(×400)

表6 各組大鼠心肌細胞Notch1蛋白平均IOD值表達情況

圖5 各組大鼠Hey2蛋白免疫組化染色圖(×400)

討 論

心肌肥厚的發(fā)生伴有炎性反應(yīng)，在心室重構(gòu)過程中，炎癥信號分子增加，各種炎性細胞在損傷部位浸潤，促進炎性細胞因子釋放[7]。炎性細胞因子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)極其復(fù)雜，促炎性細胞因子和抗炎性細胞因子的相對平衡，有助于控制炎癥，從而維持穩(wěn)態(tài)[8]。TNF-α是常見的促炎性細胞因子，其濃度上調(diào)與心室重構(gòu)存在明顯的相關(guān)性[9]。IL-10是抗炎性細胞因子，在下調(diào)炎性反應(yīng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用[10]。本研究中模型組血漿炎性細胞因子TNF-α、IL-10濃度隨著心肌肥厚的進程逐漸增加，說明模型組中促炎性細胞因子水平的增高將伴隨抗炎性細胞因子水平的升高，可能促進心肌肥厚的發(fā)生、發(fā)展。

Notch信號通路是體內(nèi)重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑之一，參與多種心血管疾病的發(fā)生、發(fā)展，主要由Notch受體、Notch配體，通路相關(guān)蛋白及其下游靶蛋白Hes1、Hey2等組成[11]。Notch家族的4個受體中，Notch1主要在心臟中表達，對損傷的心肌發(fā)揮保護作用[12]。Notch1信號通路的缺失，會加劇心肌肥厚[13]。由于Notch1失調(diào)會導(dǎo)致室間隔異常、瓣膜畸變以及心肌細胞肥大和細胞凋亡加劇[14]。在心臟中Notch信號通路下游基因Hey2在心室表達，有研究表明如果將Hey2敲除則導(dǎo)致明顯的心臟畸形[15]。本研究中模型組Notch1及Hey2的蛋白表達水平隨著心肌肥厚的進程逐漸增加，Notch信號通路可能通過負調(diào)節(jié)心臟基因表達來限制心肌細胞肥大的程度，這說明Notch在心臟發(fā)育中具有重要功能，心肌損傷后其激活表明該通路在心臟修復(fù)中發(fā)揮作用，以此達到保護心肌受損的目的，這與Croquelois等[13]的研究結(jié)論相同。

表7 各組大鼠心肌細胞Hey2蛋白平均IOD值表達情況

阿司匹林、塞來昔布均是COX-2的抑制劑，研究表明，COX-2參與了心室重構(gòu)、心力衰竭的發(fā)生和發(fā)展，與TNF-α共同促進炎性反應(yīng)的發(fā)生[16，17]。炎性反應(yīng)的發(fā)生與Notch1信號通路也相關(guān)，據(jù)文獻報道TNF-α通過NF-κB炎癥信號通路與Notch信號通路發(fā)生串擾。此外在心室重構(gòu)過程中炎性細胞浸潤，例如巨噬細胞，在巨噬細胞分化過程中，Notch1導(dǎo)致大量M1型巨噬細胞分化，促使炎性細胞因子釋放，引發(fā)炎性反應(yīng)[18]。阿司匹林、塞來昔布是非甾體類抗炎藥，長期服用阿司匹林對心臟有保護和抗氧化的作用，長期使用塞來昔布可減輕心肌肥厚和纖維化的形成[19，20]。本研究中，經(jīng)兩藥物處理可降低心肌細胞肥大、減輕心肌纖維化程度，血漿TNF-α、IL-10濃度下降顯著，表明此兩種藥物可降低心肌肥厚大鼠體內(nèi)炎性細胞因子的產(chǎn)生，達到保護心肌的療效。加藥處理后，兩組Notch1和Hey2蛋白表達量隨時間推移整體先升高后下降，與模型組比較差異有統(tǒng)計學意義，表明阿司匹林、塞來昔布可降低Notch1信號通路的活性，這提示環(huán)氧化酶抑制劑可能通過減少Notch1信號通路激活，進而降低體內(nèi)炎性反應(yīng)，從而達到保護心肌的作用。

通過塞來昔布組與阿司匹林組比較，早期塞來昔布組TNF-α、IL-10含量顯著高于阿司匹林組，后期塞來昔布和阿司匹林對降低體內(nèi)炎性細胞因子的作用比較，差異無統(tǒng)計學意義。在檢測Notch1和Hey2蛋白時，阿司匹林組在第10周達頂峰然后開始下降，而塞來昔布組第12周含量達頂峰之后開始下降，到第14周時，兩組間Notch1蛋白表達量差異無統(tǒng)計學意義。由此可見，阿司匹林及塞來昔布對壓力超負荷性心肌肥厚治療有一定顯著效果，但阿司匹林對于超負荷心肌肥厚的治療作用更加顯著，而塞來昔布作用的時間較長，發(fā)揮作用較阿司匹林遲緩，在長時間的藥物治療下，可以達到相同的治療效果。

綜上所述，環(huán)氧化酶抑制劑對壓力超負荷性心肌肥厚大鼠有一定的治療作用，且阿司匹林發(fā)揮作用較快，其機制可能與降低Notch1信號通路的活性，緩解炎性反應(yīng)有關(guān)。Notch1信號轉(zhuǎn)導(dǎo)在心臟疾病及炎性反應(yīng)中的潛在影響是廣泛的，這也提示Notch1信號通路可作為預(yù)防和治療心肌肥厚潛在的新靶點，為臨床的治療提供新的研究方向。