下調CCN1表達抑制重癥急性胰腺炎炎性反應

郭美霞 李敏利 吳曉尉 王 彬 張曉華

重癥急性胰腺炎(severe acute pancreatitis，SAP)是由多種病因導致的胰腺局部炎性和壞死，并且伴有全身性炎性反應和多器官功能損害的疾病，“炎癥瀑布”反應學說是目前國際認可的發病機制之一。研究顯示， SAP早期釋放了大量炎性介質, 并且通過一系列生物級聯放大效應, 釋放促炎性細胞因子, 主要包括TNF-α、 IL-6等，這些炎性介質在SAP 發生、發展中起重要調節作用[1，2]。CCN1是一種分泌豐富的、富含半胱氨酸的、肝素結合的細胞外基質相關蛋白，被認為具有介導細胞黏附和誘導細胞遷移的功能。研究發現，CCN1作為一種新的促炎性細胞因子參與類風濕關節炎、系統性紅斑狼瘡的發病機制，提示CCN1作為炎性介質在炎癥性疾病中扮演著重要角色，但CCN1在急性胰腺炎中的作用尚未見報道[3～5]。本研究通過觀察CCN1信號通路與促炎性細胞因子在SAP早期炎性反應過程中的變化，進一步闡明SAP炎癥發病機制。

材料與方法

1.材料和主要儀器:健康SPF級SD雄性大鼠36只，6～8周齡，體質量250g左右，購自重慶恩斯維爾生物科技有限公司。牛磺膽酸鈉購自美國Sigma公司；CCN1shRNA質粒由威斯騰生物構建，腫瘤壞死因子α (TNF-α)和AMY的ELISA 試劑盒均購自中國北京麗科創欣生物科技有限公司；垂直板電泳轉移裝置、Trans-Blot轉膜裝置、電泳儀購自美國Bio-Rad公司，多功能酶標儀購自美國Thermo Fisher公司；一抗：CCN1(兔來源)，二抗：羊抗兔IgG均購自英國Abcam公司。

2.方法：(1)動物分組及SAP模型制備：SD大鼠隨機分為空白對照組(control組)、SAP模型組(SAP組)和SAP+CCN1干預組(CCN1治療組)，每組12只。術前12h禁食，飲水自由。實驗大鼠稱重，7%水合氯醛(5ml/kg)注射于腹腔進行麻醉，將大鼠仰臥位固定，取上腹正中切口，顯露胰腺，確認胰膽管，以無創動脈夾于近肝門處夾畢胰膽管(近端于左右肝管匯合處遠，端于近十二指腸處)；在貼近十二指腸開口處逆行穿刺胰管，以微量注射器注射4%牛磺膽酸鈉，給藥劑量1ml/kg，速度0.2ml/min；為保證牛磺膽酸鈉充分進入胰腺，注射完畢后繼續將胰膽管夾畢(約5min后胰腺組織出現肉眼可見的充血、水腫)；補充腹腔積液，確認腹腔內無活動性出血后兩層關腹。對照組大鼠模擬胰膽管穿刺操作，但不予以注射任何藥物。(2)給藥方式：C組于造模前12h按照50微克/只的劑量尾靜脈注射CCN1shRNA質粒，1次注射。A、B組于相同時間點注射等量0.9%氯化鈉溶液。CCN1shRNA質粒的構建：在pLVX-shRNA2載體中構建CCN1shRNA。目的核苷酸序列:5′-GTGGAGTTAACAAGAAACA-3′。按照制造商的說明，使用EntransterTM-in vivo轉染試劑進行轉染，重組質粒測序驗證并大量抽提。(3)取材時間點：SAP建模后6、12、18h。實驗鼠稱重并麻醉，開腹于腹主動脈取血，靜置血液1～2h后離心(3000r/min，20min，4℃)，取上層血清于-20℃保存用于ELISA檢測。取胰腺組織兩份，一份放入4%多聚甲醛中4℃保存用于HE檢測；另一份置于-80℃冰箱中保存用于Western blot法檢測。

結 果

1.SAP組大鼠血清AMY水平的變化:與control組比較，SAP組大鼠血清AMY水平均明顯升高，該效應與時間呈正相關，3個時間點中18h達最高水平，各組間比較差異均有統計學意義(P均<0.05，表1)；CCN1治療組大鼠血清AMY水平較SAP組明顯下降，各組間比較，差異均有統計學意義(P均<0.05，表1)。

表1 control組、SAP組及CCN1治療組血清AMY水平變化

2.SAP組大鼠血清TNF-α表達情況:與對照組比較，SAP組血清TNF-α表達水平明顯上調，并隨著作用時間延長而逐漸升高，造模18h時升至3個時間點的最高值，與對照組比較，差異均有統計學意義(P均<0.05，表2)；CCN1治療組大鼠血清TNF-α表達較SAP組明顯下降，各組間差異均有統計學意義(P均<0.05，表2)。

表2 control組、SAP組及CCN1治療組血清TNF-α水平變化

3.胰腺組織病理學檢查:依據Kusske評分標準，從分別從水腫、炎癥、出血、壞死4個方面對各組病理進行評估比較，對照組大鼠胰腺結構未見明顯異常，腺泡結構正常，排列整齊。SAP組6h胰腺小葉正常結構發生改變，間隙增寬，間質充血水腫；SAP組12h胰腺小葉結構破壞，可見少量片狀壞死，部分間質血管破裂，并可見大量炎性細胞浸潤，胰周脂肪液化壞死；SAP 18h組胰腺組織見大量壞死區，壞死區腺泡正常結構完全消失(圖1)。與control組比較，各時間點大鼠胰腺病理評分比較，差異均有統計學意義(P均<0.05，表3)；CCN1治療組大鼠胰腺小葉結構破壞、炎性細胞浸潤較SAP組明顯減輕，與SAP組比較，各時間點大鼠胰腺病理評分差異均有統計學意義(P均<0.05，表3)。

圖1 大鼠胰腺組織病理切片(HE,×100)

表3 control組、SAP組及CCN1治療組Kusske評分(分,

4.SAP大鼠胰腺CCN1表達情況:Western blot法檢測結果顯示，CCN1在control組大鼠胰腺幾乎無表達，SAP組6h可見少量表達，隨時間延長，CCN1表達上調，SAP 12h組表達明顯增加，18h升至最高值，各時間點與control組比較，差異均有統計學意義(P均<0.05)；CCN1治療組胰腺組織CCN1表達明顯減少，各時間點與SAP組比較差異均有統計學意義(P均<0.05，圖2)。

圖2 CCN1蛋白表達檢測1～3.control組6、12、18h；4～6.SAP組6、12、18h；7～9.CCN1治療組6、12、18h；各組分別于6、12、18h檢測大鼠胰腺組織CCN1蛋白表達

討 論

重癥急性胰腺炎在發病早期，胰腺腺泡細胞受損后胰酶釋放、單核-吞噬細胞激活，大量的細胞因子釋放，從而觸發炎性介質瀑布樣級聯反應(cascades)，迅速導致的全身炎癥反應綜合征(systemic inflammatory reaction syndrome，SIRS)和多器官衰竭(multiple organ failure， MOF)。阻斷胰腺炎早期炎癥級聯反應可作為突破口，尋找胰腺炎新的治療靶點。

本課題組早期研究發現，TNF-α、IL-1、IL-6是急性胰腺炎的主要促炎性細胞因子，且血清及胰腺組織中的濃度隨造模時間延長明顯升高, 西地那非作用于牛黃膽酸鈉誘導的急性胰腺炎大鼠中，發現TNF-α、IL-6基因表達明顯被抑制后，胰腺炎癥較對照組明顯減輕[6～8]。本研究結果表明，TNF-α在SAP組大鼠血清濃度明顯升高，與之前的研究結果一致，且于造模前12h按照50微克/只的劑量尾靜脈注射CCN1shRNA質粒后，發現血清TNF-α及AMY濃度較SAP組明顯降低，表明CCN1抑制劑可通過降低炎性介質TNF-α濃度，從而達到減輕炎癥的目的。

既往研究發現CCN1可誘導炎性細胞因子單核細胞趨化蛋白-1(MCP-1)mRNA及蛋白水平表達增加，且呈劑量及時間依賴性；分別用CCN1受體阻斷劑即整合素αvβ3,FAK抑制劑，PI3K抑制劑及AKT抑制劑干預后發現NF-κB明顯抑制[9]，提示CCN1參與炎性反應的發生、發展。CCN1因其在炎癥中的作用而受到特別關注，本研究旨在探討CCN1對牛磺膽酸鈉誘導的急性胰腺炎大鼠模型的影響，結果表明，SAP組大鼠血清及胰腺組織中CCN1較control組明顯增加，隨著造模時間延長，CCN1濃度呈上升趨勢，胰腺組織炎癥壞死評分較正常對照組明顯增加，說明CCN1在急性胰腺炎中呈時間依賴性，且與胰腺組織炎癥程度呈正相關；經尾靜脈注射CCN1shRNA質粒的急性胰腺炎大鼠，血清及胰腺組織中CCN1濃度明顯降低，胰腺組織的炎癥壞死較SAP組明顯減輕。該方法對大鼠SAP模型具有良好的治療效果，抑制CCN1可降低胰腺炎癥、炎性細胞因子表達，這些發現支持了CCN1抑制劑在動物模型中的抗炎作用，這為研發急性胰腺炎新的治療靶點提供依據。

綜上所述，本研究證實了CCN1和TNF-α在急性胰腺炎中扮演重要角色，與炎癥嚴重程度呈正相關，抑制了CCN1的表達，胰腺炎癥明顯減輕，但CCN1是否是這條信號通路的始動因素，是哪個信號因子激活了這條信號通路，是否還有其他炎性細胞因子參與其中，還需要開展進一步研究，這也是本課題組下一步的研究方向。